Expression et purification de GyrB et GyrA
La séquence codant pour le GyrA complet de E. coli (2-875) a été insérée dans un pET28b modifié contenant une étiquette 10-His N-terminale et une étiquette Twin-strep C-terminale. La surexpression a été réalisée dans E. coli BL21 (DE3) pRARE2 dans un milieu LB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 35 µg/mL de chloramphénicol. Les cellules ont été induites avec 0,35 mM d’IPTG après avoir atteint une OD600 de 0,85 et la protéine a été exprimée à 37 °C pendant 4 h. Les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans un tampon de lyse (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 10% v/v glycérol, pH 8,0) et lysées avec trois cycles de désintégration à haute pression en utilisant l’EmulsiFlex-C3 à 1500 bars. La protéine GyrA a été purifiée par chromatographie d’affinité au nickel sur une colonne XK 26/20 (Pharmacia) remplie manuellement avec la résine Sepharose 6 Fast Flow Chelating (GE Healthcare) liée aux ions Ni2+. L’élution a été effectuée avec le tampon de lyse contenant 250 mM d’imidazol pH 8.0 et les protéines éluées ont été directement fixées sur un Sepharose Streptavidine (GE Healthcare) de 10 ml. Les protéines ont été lavées abondamment avec le tampon Strep (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycérol, pH 8.0) et éluées avec le tampon Strep contenant 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Le tag 10-His et le tag Twin-strep ont ensuite été clivés par la protéase PreScission (P3C) et le virus Tobacco Etch (TEV) (rapport de masse 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) pendant la nuit à 4 °C. GyrA a ensuite été purifié par une étape de chromatographie d’échange d’anions en utilisant une colonne HiTrap Q HP (GE Healthcare). La protéine a été éluée avec un gradient linéaire de 20 volumes de colonne avec le tampon B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycérol, pH 8,0). Les fractions contenant GyrA ont été regroupées et chargées sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) avec 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v/v de glycérol, pH 8,0. 37 mg de GyrA ont été obtenus à partir de 3 L de cultures. La séquence codante de GyrB (2-804) a été insérée dans le même pET28b modifié. La surexpression a été réalisée dans E. coli BL21 (DE3) pRARE2 dans un milieu LB contenant 50 µg/mL de kanamycine et 35 µg/mL de chloramphénicol. Les cellules ont été induites avec 0,35 mM IPTG après avoir atteint une OD600 de 0,85 et la protéine a été exprimée à 18 °C pendant 18 h. La procédure de purification de GyrB est celle décrite ci-dessus pour GyrA. 10 mg de GyrB ont été obtenus à partir de 3 L de cultures.
Reconstitution complète de l’ADN gyrase
E. coli GyrA et GyrB ont été mélangés à un rapport équimolaire pour permettre la reconstitution complète de l’ADN gyrase. Le complexe a été ensuite purifié sur une colonne de chromatographie d’exclusion de taille Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) en utilisant le tampon cryo-EM (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (figure 1 et figure supplémentaire. 1).
Préparation des acides nucléiques
Un duplex d’ADN de 180 pb à double entaille a été reconstitué à l’aide de 2 oligonucléotides synthétiques asymétriques phosphorylés12 obtenus auprès de Sigma-Aldrich (tableau supplémentaire 1). En bref, les acides nucléiques ont été dissous dans de l’eau sans DNAse à une concentration de 1 mM. Pour assembler l’ADN double brin, chaque oligo a été mélangé dans un rapport molaire de 1:1, puis recuit en l’incubant à 95 °C pendant 2 minutes et en diminuant la température de 1 °C toutes les 1 minutes jusqu’à atteindre 20 °C. Le duplex d’ADN doublement recuit a ensuite été soumis à un échange de tampon dans Hepes 20 mM pH 8,0 avec une colonne BioSpin 6 (BioRad).
Formation de complexes pour la cryo-EM
L’ADN gyrase purifiée a été mélangée avec l’ADNdb de 180 pb à un rapport molaire 1:1 avec une concentration finale de protéine et d’ADN de 32 µM. Le mélange a été incubé pendant 10 min à 37 °C. La gépotidacine (GSK2140944, achetée chez MedChemExpress) remise en suspension à 10 mM dans du DMSO à 100% a été ajoutée pour atteindre une concentration finale de 170 µM (1,7% DMSO). Le mélange a été incubé pendant 10 minutes à 37 °C. L’AMP-PNP (Sigma) a été ajouté au complexe à une concentration finale de 340 µM. Le complexe entièrement reconstitué a été incubé pendant 30 min à 30 °C. Enfin, du CHAPSO 8 mM (Sigma-Aldrich) a été ajouté au complexe. L’échantillon a été centrifugé 2 h à 16 000 × g pour éliminer les agrégats potentiels.
Préparation de la grille Cryo-EM
Les grilles de cuivre de 300 mailles Quantifoil R-1.2/1.3 ont été chargées par incandescence pendant 20 s avant l’application de 4 µl du complexe. Après 30 s d’incubation, les grilles ont été congelées en plongée dans de l’éthane liquide à l’aide d’un Vitrobot mark IV (FEI) avec une humidité de chambre de 95 % à 10 °C.
Microscopie électronique
L’imagerie cryo-EM a été réalisée sur un microscope Titan Krios fonctionnant à 300 kV (FEI) équipé d’une caméra électronique directe K2 Summit (Gatan), d’un filtre énergétique GIF Quantum (Gatan) fonctionnant en mode zéro perte d’énergie avec une largeur de fente de 20 e-V, d’une plaque de phase Volta (FEI) et d’un correcteur CS (FEI). Les images ont été enregistrées en mode nanosonde EFTEM avec Serial EM53 en mode de comptage à super-résolution à un grossissement nominal de 130 000x avec une taille de pixel à super-résolution de 0,44 Å et une cible à défocalisation constante de -500 nm (figure supplémentaire 2c). Le VPP a été déplacé vers une nouvelle position toutes les 100 minutes (figure supplémentaire 2b). Quatre ensembles de données ont été collectés avec un débit de dose de 6 à 8 e-/pixel/s (taille de pixel de 0,88 Å au niveau du spécimen) sur le détecteur. Les images ont été enregistrées avec une dose totale de 50 e-/Å2, un temps d’exposition de 7 à 10 s et des sous-trames de 0,2 à 0,25 s (35 à 50 images au total). Un total de 11 833 films a été enregistré après la collecte des données des 4 ensembles de données.
Traitement des données
Le traitement des données de chaque ensemble de données a été effectué séparément en suivant la même procédure jusqu’aux raffinements 3D lorsque les particules ont été fusionnées. Les sous-trames super-résolution fractionnées en fonction de la dose ont été corrigées en gain avec IMOD54 et binées deux fois par recadrage de Fourier, corrigées en fonction de la dérive et pondérées en fonction de la dose à l’aide de MotionCor255, ce qui a permis d’obtenir des images additionnées d’une taille de pixel de 0,88 Å. La fonction de transfert de contraste des micrographies corrigées a été estimée en utilisant GCTF v1.0656. Les anneaux de thon ont été inspectés manuellement pour vérifier l’astigmatisme et les micrographies dont la résolution mesurée était inférieure à 4 Å ont été écartées, ce qui a donné 8 701 micrographies restantes. Les particules ont été automatiquement sélectionnées par un protocole de sélection de blob gaussien sans référence dans RELION229,30. En considérant les 4 ensembles de données, un total de 1 572 962 particules a été sélectionné. Les particules de chaque ensemble de données ont été soumises séparément à deux séries de classification 2D dans RELION2 pour éliminer les particules inutiles et les contaminations, ce qui a permis d’obtenir un total de 479 667 particules pour la suite du traitement. Les particules des quatre ensembles de données ont été fusionnées en un seul ensemble de données, suivi d’une ré-extraction avec centrage dans un format binné 3 × 3. Une dernière série de classification 2D a ensuite été effectuée, ce qui a donné une pile finale de 338 616 particules. Cette pile de particules a ensuite été soumise à un cycle de classification 3D ab-initio dans cryoSPARC31. Après avoir écarté les modèles de mauvaise qualité, le modèle ab-initio restant a donné un ensemble de données final de 191 456 particules, avec un seuil de probabilité de classe de 0,9 (figure supplémentaire 2a). Le modèle ab-initio a fait l’objet d’un filtrage passe-bas à 30 Å et a été utilisé comme référence pour un raffinement homogène dans cryoSPARC, ce qui a permis d’obtenir une carte de 5,4 Å. Les coordonnées des particules raffinées ont ensuite été utilisées comme référence pour le modèle ab-initio. Les coordonnées raffinées des particules ont ensuite été utilisées pour l’estimation locale du FCT à l’aide de GCTF v1.06, suivie d’une nouvelle extraction de particules binées 2 × 2 avec centrage. Cette nouvelle pile de particules a été soumise à un auto-raffinement 3D dans RELION2 en utilisant le modèle ab-initio filtré en passe-bas à 30 Å, ce qui a permis d’obtenir une carte avec une résolution globale de 5,0 Å (figure supplémentaire 3). La résolution locale a montré une gamme de résolution allant de 4,0 Å dans le noyau de liaison/clivage de l’ADN à 9,0 Å dans le domaine ATPase et la roue β-pin de GyrA enveloppant l’ADN, ce qui indique une grande flexibilité de ces deux modules. Pour obtenir une reconstruction finale du complexe complet avec des densités bien définies pour chaque domaine, nous avons effectué une classification 3D sans alignement, ce qui a donné plusieurs classes différentes. Les particules de trois classes ont été fusionnées (94 633 particules). L’empilement subséquent de particules binées 1 × 1 a été raffiné dans RELION2 sans masque jusqu’aux dernières itérations de raffinement où un masque doux a été appliqué pour améliorer la résolution. Le post-traitement de la carte a permis d’obtenir une reconstruction à 6,6 Å de résolution du complexe global (figure supplémentaire 3).
Une combinaison de différentes approches locales a été utilisée pour identifier différentes conformations et améliorer la résolution locale de chaque domaine. Le domaine ATPase étant trop petit pour un raffinement 3D focalisé, nous avons d’abord effectué une classification 3D focalisée du domaine ATPase avec un masque doux et sans alignement dans RELION2. Une classe de 58 329 particules avec une densité bien définie du domaine de l’ATPase a été sélectionnée, suivie d’une ré-extraction de particules binées 1 × 1 donnant des particules avec une taille de pixel de 0,88 Å/pixel. Pour faciliter un alignement précis des particules, cette classe a été affinée dans RELION2 en utilisant un masque souple autour du domaine ATPase et du domaine de liaison/clivage de l’ADN, ce qui a donné une carte de résolution globale de 5,9 Å (ATPase-Core) (figure supplémentaire 3).
Deuxièmement, nous avons effectué une classification 3D ciblée de la roue β-pin de GyrA avec un masque souple et sans alignement dans RELION2. Une classe de 45 040 particules avec une densité bien définie de la roue β-pin de GyrA a été sélectionnée, suivie d’une ré-extraction de particules binées 1 × 1 donnant des particules avec une taille de pixel de 0,88 Å/pixel. Cette classe a été affinée dans RELION2 à l’aide d’un masque souple autour de la roue β-pin et du domaine de liaison/clivage de l’ADN, ce qui a donné une carte de résolution de 6,3 Å (CTD-Core) (figure supplémentaire 3).
Enfin, un auto-raffinement 3D ciblé a été effectué dans RELION2 à l’aide d’un masque souple autour du domaine de liaison/clivage de l’ADN. Le post-traitement de la carte a produit une reconstruction de 4,3 Å de résolution du domaine de liaison/clivage de l’ADN. Ensuite, une classification 3D ciblée du domaine de liaison/clivage de l’ADN a été réalisée. Deux des classes ont montré de meilleures précisions angulaires et des conformations fermées (60 548 particules) et pré-ouverture (53 655 particules) distinctes du domaine de liaison et de clivage de l’ADN. Ces deux classes ont été affinées dans RELION2 par un raffinement 3D focalisé avec une symétrie C2 en utilisant des particules binées 1 × 1 et ont donné des reconstructions avec une résolution globale de 4,0 et 4,6 Å après post-traitement, respectivement (figure supplémentaire 3). Le domaine fermé de liaison/clivage de l’ADN a été affiné par un raffinement 3D focalisé utilisant un masque souple, qui exclut l’insertion TOPRIM désordonnée donnant une carte de 4,0 Å de haute qualité (figure supplémentaire 3).
Construction du modèle et raffinement
La reconstruction EM du domaine de liaison/clivage de l’ADN dépourvu de l’insertion TOPRIM résolue à 4,0 Å était de la meilleure qualité. Presque toutes les chaînes latérales pouvaient être vues et la densité de Gepotidacin était clairement visible. Cette carte a été utilisée pour affiner une structure cristalline du domaine de liaison/clivage de l’ADN de l’ADN gyrase d’E. coli17. Un modèle atomique dimérique du domaine de liaison/clivage de l’ADN a été généré en utilisant le PDB 3NUH dans PyMol (Schrodinger L.L.C.). Le modèle atomique suivant a été dépouillé des acides aminés appartenant à l’insertion TOPRIM, de tous les ions et des molécules d’eau, avec toutes les occupations fixées à 1 et les facteurs B fixés à 50. Le modèle atomique a d’abord été ajusté par un corps rigide dans la carte filtrée et affinée avec Chimera61. Un premier tour de raffinement dans l’espace réel dans PHENIX62 a été effectué en utilisant un ajustement local dans l’espace réel et un raffinement global par minimisation guidée par le gradient. Ensuite, 20 acides nucléiques de la structure de l’ADN gyrase de S. aureus41 (PDB 5IWM) ont été copiés et ajustés dans notre modèle atomique. La séquence d’ADN a été modifiée en fonction de l’ADN utilisé dans notre structure. Les résidus de protéines et les acides nucléiques manquants ont été construits manuellement dans COOT63. Le modèle atomique et le dictionnaire de contraintes de la gépotidacine (GSK-2140944) ont été générés avec le serveur Grade (http://grade.globalphasing.org). La gépotidacine a ensuite été ajustée manuellement dans la densité électronique vide dans COOT, puis dupliquée. Les deux duplicatas ont été réglés sur une occupation de 0,5. Plusieurs cycles d’affinement dans l’espace réel dans PHENIX en utilisant des contraintes pour la structure secondaire, les rotamères, Ramachandran et la symétrie non cristallographique ont été effectués, toujours suivis d’une inspection manuelle dans COOT, jusqu’à ce qu’un modèle convergent soit obtenu. Enfin, les facteurs B ont été raffinés par un dernier tour de raffinement en espace réel dans PHENIX en utilisant les mêmes paramètres que précédemment. Après que le raffinement ait convergé, les coordonnées atomiques de l’insertion TOPRIM ont été ajoutées au modèle atomique. Il a été affiné dans les reconstructions EM contenant la densité d’insertion dans les états fermé et pré-ouvert en utilisant la même procédure. Une validation croisée par demi-map a été effectuée pour définir 1,5 comme étant le meilleur poids de raffinement dans PHENIX permettant de réduire le clash atomique et d’éviter le surajustement du modèle (figure supplémentaire 4e). Toutes les étapes de raffinement ont été effectuées en utilisant la limite de résolution des reconstructions selon le critère de l’étalon-or FSC-0.14357. Les paramètres de raffinement, les statistiques du modèle et les scores de validation sont résumés dans le tableau supplémentaire 2. Les modèles atomiques du domaine de liaison/clivage de l’ADN d’E. coli dans les conformations fermées (avec et sans insertion) et de pré-ouverture ont été déposés dans la Banque de données des protéines sous les numéros d’accession 6RKU, 6RKS, 6RKV, respectivement.
Pour le complexe global, nous avons utilisé une combinaison de différentes reconstructions EM pour construire le modèle atomique du complexe global de l’ADN gyrase. La structure ATPase-Core résolue à 5,9 Å a été utilisée pour ajuster de manière rigide dans Chimera la structure cristalline du domaine ATPase en complexe avec ADPNP32 (PDB 1EI1) et le domaine de liaison/clivage de l’ADN raffiné en conformation fermée. La qualité de la densité électronique a permis de construire dans COOT les résidus manquants du linker entre le domaine ATPase et le domaine de liaison/clivage de l’ADN. La structure CTD-Core résolue à 6,3 Å a été utilisée pour ajuster de façon précise la structure cristalline β-pinwheel10 dans Chimera. Les 10 acides aminés manquants (564-574) suivant la boîte GyrA ont été ajoutés à l’aide du serveur de modélisation Phyre264. La qualité de la densité électronique a permis de construire dans COOT les acides nucléiques manquants autour de la β-pinwheel ainsi que les 10 acides aminés reliant les derniers résidus de GyrA à la β-pinwheel. Sur la base d’une prédiction de structure secondaire, une partie du linker a été construite comme une hélice alpha (Fig. 3). Le modèle atomique suivant contenant le domaine ATPase, le domaine de liaison/clivage de l’ADN et une β-pinwheel a été ajusté par un corps rigide dans la structure complexe globale résolue à 6,6 Å en utilisant Chimera. Ensuite, une copie de la première β-pinwheel a été ajustée dans la densité de la seconde β-pinwheel dans COOT. Les acides nucléiques manquants autour de la deuxième β-pinwheel ainsi que les 10 résidus manquants du linker ont été construits manuellement dans COOT. Le modèle atomique résultant a été dépouillé de tous les ions et molécules d’eau, avec toutes les occupations fixées à 1 et les facteurs B fixés à 50. Enfin, le raffinement dans l’espace réel du modèle atomique par rapport à la structure globale du complexe a été effectué dans PHENIX à l’aide d’un corps rigide et d’un raffinement par minimisation globale pilotée par le gradient. La limite de résolution pour le raffinement a été fixée selon le critère FSC-0.143 de la norme or57. Des validations croisées par demi-map ont également été réalisées (figure supplémentaire 4e). Les paramètres de raffinement, les statistiques du modèle et les scores de validation sont résumés dans le tableau supplémentaire 2. Le modèle atomique de la structure globale a été déposé dans la Protein Data Bank sous le numéro d’accession 6RKW. Toutes les figures ont été créées avec Chimera61, ChimeraX65 et PyMol (Schrodinger L.L.C.).
Purification de E. coli GyrB R286K, R286Q, et E264A
Le pET28b modifié utilisé pour la surexpression de E. coli GyrB de type sauvage a été muté par mutagenèse dirigée par site à l’aide du kit de mutagenèse dirigée par site QuikChange XL (Agilent) afin de générer trois plasmides hébergeant les mutations R286K, R286Q ou E264A (tableau supplémentaire 4). Les procédures de surexpression et de purification des trois mutants sont identiques à celles de la GyrB de type sauvage décrites ci-dessus dans la section Méthodes.
Purification de T. thermophilus GyrB K284R, K284Q
Le pET28b modifié utilisé pour la GyrB de type sauvage T. thermophilus GyrB de type sauvage12 a été muté par mutagenèse dirigée par site en utilisant le kit de mutagenèse dirigée par site QuikChange XL (Agilent) afin de générer deux plasmides hébergeant les mutations K284R ou K284Q (tableau supplémentaire 4). Les procédures de surexpression et de purification des deux mutants sont identiques à celles du GyrB de type sauvage d’E. coli décrites ci-dessus dans la section Méthodes.
Dossier de superenroulement de l’ADN
Une concentration croissante d’ADN gyrase (GyrA2B2) a été incubée à 37 °C avec 6 nM de plasmide pUC19 relaxé dans un mélange réactionnel contenant 20 mM de Tris-acétate pH 7,9, 100 mM d’acétate de potassium, 10 mM d’acétate de magnésium, 1 mM de DTT, 1 mM d’ATP, 100 µg/ml de BSA. Après 30 min, les réactions ont été arrêtées par l’ajout de SDS 1%. L’électrophorèse sur gel d’agarose a été utilisée pour suivre la conversion de la pUC19 relaxée en forme superenroulée. Les échantillons ont été passés sur un gel d’agarose à 0,8 %, tampon Tris Borate EDTA 1X (TBE), à 6 V/cm pendant 180 min à température ambiante. Les gels d’agarose ont été colorés avec 0,5 mg/ml de bromure d’éthidium dans du TBE 1X pendant 15 minutes, puis 5 minutes de décoloration dans l’eau. Les topoisomères d’ADN ont été révélés à l’aide d’un Typhoon (GE Healthcare).
Dosage de l’activité atpase
L’hydrolyse de l’ATP est mesurée en suivant l’oxydation du NADH médiée par la pyruvate kinase (PK) et la lactate déshydrogénase (LDH). L’absorbance a été suivie à 340 nm pendant 600 s à 37 °C avec un spectrophotomètre Shimadzu 1700. Les réactions ont été enregistrées en triplicata avec 50-100 nM de GyrA2B2 et 16 nM d’ADN linéaire (pCR-blunt) dans 500 µl d’un tampon contenant 50 mM de Tris HCl pH 7,5, 150 mM d’acétate de potassium, 8 mM d’acétate de magnésium, 7 mM de BME, 100 µg/mg de BSA, 4U/5U de mélange PK/LDH, 2 mM de PEP, et 0.2 mM NADH.
Alignement multiple et conservation évolutive des résidus
Séquences de la protéine ATPase/Transducteur de GyrB provenant de 30 espèces (codes Uniprot : GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor ; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes ; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens ; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii ; GYRB_ECOLI, Escherichia coli ; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae ; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium ; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus ; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae ; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae ; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri ; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile ; GYRB_RICFE, Rickettsia felis ; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis ; GYRB_BORBU ; Borrelia burgdorferi ; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis ; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis ; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus ; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus ; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae ; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima ; GYRB_THET8, Thermus thermophilus ; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis ; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori ; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis ; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae ; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus ; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) ont été alignés en utilisant le serveur Clustal Omega (EMBL-EBI). L’alignement ultérieur a été utilisé pour tracer la conservation évolutive des acides aminés sur la structure ATPase/transducteur (PDB ID 1EI1) en utilisant le serveur ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). L’arbre phylogénétique a été généré par la méthode d’assemblage par voisinage en utilisant l’alignement multiple dans Clustal Omega.
Résumé du rapport
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport de Nature Research lié à cet article.