Subjekt
Denna studie omfattade 88 behandlingsnaiva LC-patienter utan fjärrmetastaser. Alla patienter diagnostiserades med laryngealt skivepitelcancer genom patologisk undersökning av prover och behandlades vid Otorhinolaryngologiavdelningen, huvud- och nackkirurgi, University of the Ryukyus, mellan januari 2008 och december 2017. Patienternas slutliga prognos bedömdes i juli 2018. Klassificering av tumör-, nod- och metastasstadiet (TNM) utfördes enligt AJCC Staging Manual (7th edition). För att fastställa det kliniska stadiet och för att upptäcka samtidig multipel primärcancer genomgick patienterna fysiska och endoskopiska undersökningar av övre mag-tarmkanalen, ultraljudsinspektion av halsen, datortomografi (CT) och 18F-fluorodeoxyglukos-positronemissionstomografi CT-avbildning.
Denna studie godkändes av institutionella granskningsnämnden vid Ryukyusuniversitetet och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen från 1975, reviderad 2008. Informerat samtycke inhämtades från alla LC-patienter före inskrivning.
Behandling
Den huvudsakliga behandlingen av den primära lesionen med kurativt syfte var konventionell strålbehandling (RT) ensam eller laserresektion i T1, samtidig kemoradioterapi (CCRT) i T2, CCRT eller kirurgi i T3, och kirurgi i T4, oberoende av förekomst av HPV. Nodala lesioner hanterades med CCRT eller halsdissektion i kombination med resektion av den primära lesionen. Alla patienter som fick RT (total dos, 70 Gy) hade CT-assisterad tredimensionell strålbehandlingsplanering i behandlingsposition med maskimmobilisering. Protokollet för CCRT var som tidigare rapporterats . När primärtumören i T3 inte visade ett partiellt svar oavsett halslymfkörtelrespons vid 39,6 Gy bestrålning, genomgick patienterna kurativ kirurgi för primärlesionen i kombination med halsdissektion.
Detektion av HPV-status och p16-immunohistokemi
Alla vävnadsprover från primära lesioner utan någon strålning eller kemoterapi analyserades med polymeraskedjereaktion (PCR) för HPV-DNA-detektion med hjälp av färska frysta prover, som erhölls vid biopsi eller kirurgisk resektion, och p16-immunohistokemi med hjälp av FFPE-prover. Fall med negativa HPV-detektionsresultat på PCR och p16-överexpression (≥75 % positiva celler och minst måttlig färgningsintensitet) utvärderades ytterligare för HPV-status med hjälp av in situ-hybridisering (ISH) med HPV-DNA-sonder (DNA ISH) . Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) för virusbelastning och fysisk status, enligt beskrivningen nedan, utfördes i fall som hade HPV-16 .
PCR för HPV-DNA-detektion
I korthet isolerades DNA från tumörproverna med hjälp av ett Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). DNA:s närvaro och integritet verifierades i alla prover genom PCR-amplifiering av β-globingenen med hjälp av primrarna PC04 och GH20 . De allmänna konsensusprimeruppsättningarna GP5+/GP6+ och MY09/MY11 användes för att analysera förekomsten av HPV-DNA genom PCR (tabell 1) enligt tidigare beskrivning . Dessutom återamplifierades DNA-prover som var negativa för GP5+/GP6+ eller MY09/MY11 PCR med hjälp av en nested PCR-metod med primerparet GP5+/GP6+. PCR-produkter av förväntad storlek (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) renades och sekvenserades direkt med en ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvenserna anpassades och jämfördes med hjälp av BLAST-programmet med sekvenser av kända HPV-typer i GenBank-databasen.
p16-immunohistokemi
Immunohistokemi för p16 utfördes med hjälp av ett CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Tyskland) i enlighet med tillverkarens protokoll . Immunmärkning visualiserades genom inkubation i 3,3′-diaminobenzidin och färgade objektglas kontrafärgades med hematoxylin.
Den poängsättning av p16-immunoreaktivitet som användes i denna studie var följande: 0, ingen färgning; 1, 1 – < 25 % av tumörcellerna positiva för p16; 2, 25 – < 50 % positiva; 3, 50 – < 75 % positiva; 4, ≥75 % positiva och svag färgningsintensitet; och 5, ≥75 % positiva och minst måttlig färgningsintensitet. Termen ”p16-överuttryck” (p16-positiv) definierades som en poäng på 5 i denna studie.
ISH med HPV DNA-sonder
Biotinyltyramidbaserad ISH utfördes med hjälp av GenPoint™ HPV biotinylerad DNA-sond och GenPoint tyramid-signalförstärkningssystemet för biotinylerade sonder i enlighet med tillverkarens protokoll (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). GenPoint HPV-biotinylerad DNA-sond reagerar med HPV-typerna 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 och 68 i 4 μm tjocka sektioner av FFPE-prover. Detektion av den hybridiserade sonden utfördes med GenPoint-detektionssystemet enligt tillverkarens protokoll, med de inkluderade primära streptavidin-horseradishperoxidas (HRP), biotinyltyramid, sekundära streptavidin-HRP och 3,3′-diaminobenzidin l (Dako; Agilent Technologies). Objektglasen kontrafärgades med hematoxylin.
Uppskattning av virusbelastning och fysisk status för HPV-16 med qPCR
För att utvärdera virusbelastning och fysisk status för HPV-16 utfördes qPCR enligt tidigare beskrivning . I korthet användes primers och TaqMan-prober som var inriktade på HPV-16:s öppna läsramar E2 och E6 (tabell 1). Primerna och proberna känner igen E2:s hinge-region, som tas bort vid HPV-16-integration. Två standardkurvor för E2- och E6-generna skapades genom amplifiering av 10-faldiga serieutspädningar (101, 102, 103, 104, 105 och 106 virala kopior) av plasmidet pB-actin early, som var en gåva från Karl Munger, och som bär på hela HPV-16:s tidiga genregion (Addgene plasmid # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Viral DNA-belastning bedömdes genom att beräkna E6-kopieringsantalet. En extern standardkurva skapades med hjälp av kända seriella utspädningar (0,3, 3, 30 och 300 ng) av humant genomiskt placentadNA (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) för kvantifiering av cellulärt DNA, och β-globin amplifierades enligt tidigare beskrivning. Mängden DNA beräknades genom att plotta Cq-värdena mot standardkurvans logaritm. Den fysiska statusen för HPV-16 bedömdes utifrån en tidigare publicerad metod . Ett E2/E6-förhållande ≥ 1 indikerar att den episomala formen dominerar, medan ett förhållande mellan antalet E2-kopior/totalt E6 < 1 indikerar förekomsten av både integrerade och episomala former (blandad form)
Detektering av E6 mRNA-uttryck genom qPCR och RNA-ISH hos HPV-16-positiva patienter med p16-övertäckning
E6 mRNA-uttryck detekterades i prover från patienter som identifierats som HPV-16-positiva med p16-övertäckning. Totalt RNA extraherades från frysta vävnader med RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japan) enligt tillverkarens anvisningar. Totalt RNA (500 ng) användes för att syntetisera första strängen cDNA med hjälp av ett PrimeScript™ RT Reagent Kit med gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) enligt tillverkarens anvisningar. För att mäta HPV-16 E6 mRNA-uttryck utfördes qPCR med hjälp av CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) och TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Primers och TaqMan-prober (tabell 1) som är riktade mot HPV-16 E6-genen och β-actin-genen användes . β-actinsonden märktes med FAM i 5′-änden och med TAMRA i 3′-änden (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Amplifikationsförhållandena var följande: 2 minuter vid 50 °C, 10 minuter vid 95 °C och en tvåstegscykel av 95 °C i 15 s och 60 °C i 60 s för totalt 40 cykler. Två standardkurvor genererades för generna E6 och β-actin genom amplifiering av seriella 10-faldiga utspädningar (101, 102, 103, 104, 105 och 106 kopior) av plasmidet pB-actin early och plasmidet pCAG-mGFP-actin, som var en gåva från Ryohei Yasuda, och som bär på den fullständiga kodningsregionen för β-actin (Addgene plasmid # 21948; Addgene). Uttrycket av E6-genen i varje prov normaliserades med mängden av den interna kontrollen β-actin.
RNA ISH för HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA utfördes med hjälp av ett RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet avparaffiniserades seriella 4 μm tjocka sektioner av FFPE-prover i xylen och rehydratiserades med hjälp av en graderad alkoholserie. Endogent peroxidas blockerades med RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent i rumstemperatur i 10 minuter. RNAscope® Target Retrieval Reagent användes i RNAscope® Target Retrieval Reagent vid 100 °C i 15 minuter. Objektglasen smältes med RNAscope® Protease Plus vid 40 °C i 30 minuter. HPV-16/- 18 E6/E7 RNA-sonden (RNAscope® Probe-HPV16/18) tillsattes till sektionerna och ett täckglas applicerades. Objektglasen överfördes till en fuktig kammare för hybridisering vid 40 °C i 2 timmar. Därefter avlägsnades täckglasen och objektglasen tvättades med RNAscope® Wash Buffer Reagent vid 40 °C. Signalförstärkning utfördes enligt tillverkarens anvisningar. Detektion av den hybridiserade sonden utfördes med hjälp av 3,3′-diaminobenzidin (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Objektglasen kontrafärgades med hematoxylin. Positiva kontrollglas (HeLa-celler som uttrycker HPV-18 E6/E7 mRNA) ingick i RNA ISH. Positiv färgning identifierades som bruna punktformiga prickar som sågs i kärnan och/eller cytoplasman.
Statistisk analys
Pearsons chi-två-test användes för att jämföra LC-patienternas egenskaper enligt HPV-DNA- och p16-överuttrycksstatus. Kumulativ överlevnad (CS) beräknades med Kaplan-Meier-metoden och jämfördes mellan två grupper med hjälp av log-rank-testet. Alla analyser utfördes med SPSS Statistical Package (SPSS, version 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 ansågs vara signifikant.