In vitro antimikrobiell känslighet hos Aerococcus urinae för 14 antibiotika, och time-killkurvor för penicillin, gentamicin och vankomycin

Abstract

Aerococcus urinae är en nykomling i klinisk och mikrobiologisk praxis och orsakar urinvägsinfektioner, bakteriemi/septikemi och/eller endokardit. I denna studie presenteras för första gången en utvärdering av aktiviteten hos en representativ panel av antibiotika mot ett stort antal isolat av A. urinae. In vitro känslighet (MIC) hos 56 isolat av A. urinae för 14 antibiotika bestämdes genom agarutspädning. I allmänhet uppvisade A. urinae-isolat liten variabilitet mellan isolaten och hade låga MIC-värden för penicillin, amoxicillin, piperacillin, cefepime, vankomycin och rifampicin. Ingen av isolaten uppvisade hög aminoglykosidresistens. Måttlig till god aktivitet sågs med kinoloner, erytromycin och tetracyklin. Isolat från två patienter med endokardit undersöktes med time-killkurvor för penicillin, gentamicin och vankomycin. Enbart penicillin och vankomycin uppvisade långsam eller ingen bakteriedödande aktivitet mot de två stammarna. När man kombinerade antingen penicillin eller vankomycin med gentamicin erhölls snabb bakteriedödande aktivitet för båda stammarna med båda kombinationerna. Behandlingsalternativen för A. urinae verkar omfatta penicilliner för mindre allvarliga fall. I allvarliga fall, dvs. endokardit, tyder tidsdödsundersökningarna på en gynnsam effekt av kombinationen med gentamicin. Hos penicillinallergiska patienter utgör vancomycin i kombination med gentamicin det mest uppenbara alternativet.

Introduktion

Under det senaste decenniet har den kliniska relevansen av olika katalasnegativa, grampositiva cocci fått stor uppmärksamhet.1 Bland dessa är Aerococcus urinae en nykomling i klinisk och mikrobiologisk praxis, som först rapporterades 19892 och utsågs 1992.3A. urinae-isolat identifierades ursprungligen genom sin cellmorfologi (Staphylococcus-liknande i Gram-färg) och tillväxtegenskaper (liknar α-hemolytiska streptokocker på blodagar), en negativ katalasereaktion och ett mycket konstant antibiogram som visar känslighet för penicillin och resistens mot sulfonamider och aminoglykosider.2-4 I två rapporter har A. urinae-stammar isolerats från 0,4-0,8 % av de undersökta urinproverna.2,5 De flesta patienter från vilka A. urinae isolerades var äldre med predisponerande tillstånd och tecken på urinvägsinfektion.2,4,5 Stammar som orsakar urinvägsinfektioner har konstaterats i Danmark, Sverige, Nederländerna, Frankrike, USA, Kanada och sydamerikanska länder.6 6 A. urinae har också isolerats från blod från patienter som drabbats av urogen bakteriemi/septikemi med eller utan endokardit.7-11 I en landsomfattande undersökning i Danmark från 1987 till 1995 identifierades 26 patienter med A. urinae isolerad från blod,6 vilket motsvarar 0,5 patienter/år/1 miljon invånare och 0,8 % av de infektiösa endokarditepisoderna.8 Bakteriehemiska/septikemiska episoder svarade väl på behandling med β-laktamer ensamma eller i kombination med en aminoglykosida, såvida inte bakteriemi komplicerades med endokardit, i vilket fall fem av sex patienter dog. Hos en patient kunde A. urinae vid obduktion odlas från klaffarna, trots till synes relevant antibiotikabehandling. Därför måste den optimala behandlingen av endokardit med A. urinae fastställas.

Testning av A. urinae-isolat med hjälp av tablett/diskdiffusionsmetoder har visat att de är känsliga för ett brett spektrum av antimikrobiella medel, inklusive både β-laktamantibiotika och andra antibiotika än β-laktamantibiotika.5,6,12 Eftersom A. urinae-isolat främst har förknippats med urinvägsinfektioner är det anmärkningsvärt att stammarna har visat sig vara resistenta mot sulfonamider och andra antimikrobiella medel som används för behandling av urinvägsinfektioner, inklusive co-trimoxazol, trimetoprim, nalidixinsyra och polymyxiner2,5,6,12. Nyligen har känsligheten hos två A. urinae-isolat från endokarditpatienter undersökts med hjälp av MIC för sju antibiotika, och man har utfört time-killkurvor för penicillin i kombination med gentamicin eller netilmicin.11 I den föreliggande studien karaktäriseras känslighetsmönstret hos 56 A. urinae-isolat av olika geografiskt ursprung ytterligare. MIC för 14 antibiotika bestämdes, och för två isolat utfördes experiment med time-killkurvor med penicillin, gentamicin och vankomycin, ensamt eller i kombination, för att få mer information om optimala behandlingsregimer för allvarliga infektioner orsakade av A. urinae.

Material och metoder

Stammar

Femtiosex epidemiologiskt obesläktade kliniska isolat av A. urinae studerades, varav 42 danska isolat (17 blod- och 25 urinisolat) och 14 icke-danska urinisolat: ett från Nederländerna (vänligen tillhandahållet av P. J. G. M. Rietra), fyra från Sverige (vänligen tillhandahållet av E. Falsen, Culture Collection, Göteborgs universitet) och sju nordamerikanska isolat (vänligen tillhandahållet av R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Följande referensstammar användes: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 och Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Antimikrobiella medel

Följande antimikrobiella medel användes: Bensylpenicillin (Leo, Ballerup, Danmark), cefepim (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA), amoxicillin, ceftriaxon, erytromycin, amikacin, gentamicin, netilmicin, rifampicin och vankomycin (Sigma, St Louis, MO, USA); Oxytetracyklin (Rosco, Taastrup, Danmark), piperacillin (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloxacin (Bayer, Leverkusen, Tyskland) och sparfloxacin (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Frankrike).

MIC-bestämning

På grund av den snabba tillväxten hos A. urinae måste testförhållandena ändras från standardrekommendationerna för att kunna utföra MIC-bestämningar (dvs. 5 % blodtillskott i agaren och inkubation i 5 % CO2-atmosfär i 48 timmar).13-15 MIC bestämdes med hjälp av agarutspädningsmetoden. Tvådubbla serieutspädningar av antimikrobiella medel framställdes i Mueller-Hinton-agar (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Tyskland) kompletterad med 5 % lyserat hästblod. Antibiotika testades från 0,008 till 512 mg/L, utom amoxicillin (0,032-256 mg/L), rifampicin (0,008-32 mg/L) och oxytetracyklin (0,008-2 mg/L). Inokula på 107 cfu/mL (104 cfu/fläcka) framställdes från agarkulturer över natten och suspenderades i 0,9 % NaCl, och applicerades med en 21-punkts multipelinokulator (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). Resultaten avlästes efter två dagars inkubation vid 37 °C i 5 % CO2. MIC avlästes som den lägsta koncentrationen som visade tillväxt av högst tre kolonier.

Tidsdödskurvor

Två av de testade blodisolaten (B1 och B8), båda från patienter med endokardit, undersöktes. Stammarna testades mot penicillin (MIC 0,125 respektive 0,6 mg/L), gentamicin (MIC 256 respektive 64 mg/L) och vankomycin (MIC 0.5 respektive 1 mg/L) i följande kliniskt tillgängliga koncentrationer: penicillin 2 × och 10 × MIC (P2 respektive P10), vankomycin 4 × och 10 × MIC (V4 respektive V10), gentamicin 10 mg/L (G10) och kombinationerna penicillin + gentamicin och vankomycin + gentamicin i följande koncentrationer: P2G10, P10G10, V4G10 respektive V10G10. Vid t = -1 h suspenderades färska kolonier som vuxit över natten till ca 105 cfu/mL i rör med förvärmd Todd-Hewitt-buljong. Rören placerades i ett vattenbad vid 37 °C. Vid t = 0 h tillsattes antibiotika, som förberetts omedelbart före analysen, till rören i två exemplar. Tre rör utan antibiotika användes som tillväxtkontroll. Prover i två exemplar togs vid 0, 3, 6 och 24 timmar från varje rör. Proverna späddes seriellt och utplacerades. Antalet överlevande kolonier räknades efter inkubation över natten vid 37 °C i rumsluft i plastpåsar tillsammans med vått silkespapper. Med 20 μL prover var det minsta antal bakterier som kunde räknas 50 cfu/mL. Överföringseffekten eliminerades för penicillin-gentamicinförsöken genom att tillsätta 100 μL 100 000 U/mL penicillinas till varje platta. För vancomycin-gentamicin-försöken eliminerades överspillningseffekten genom utspädning. En pilotundersökning visade att det fanns en övervältringseffekt i 100-provet men inte i 10-1-provet, varför cfu räknades med hjälp av 200 μL av 10-1-proven, vilket fortfarande ger en detektionsgräns på 50 cfu/mL. Alla experiment utfördes minst två gånger på olika dagar. Bakteriedödande aktivitet definierades som en minskning av inokulumet med minst 99,9 % inom 24 timmar. Synergi (S), additiv effekt (A) och antagonism definierades som: >2 log mer dödande (S), >1 och <2 log mer dödande (A) respektive >2 log minskad dödande för kombinationen jämfört med det bästa av de enskilda antibiotikorna.

Resultat

Bestämning av MIC

MIC-värdena som erhållits för de 56 isolaten visas i tabellen. Med hjälp av de brytpunkter för streptokocker som rekommenderas av NCCLS14,15 eller av den svenska referensgruppen för antibiotika (SRGA),16,17 var isolaten mottagliga för penicillinerna, medan minskad känslighet konstaterades för de testade cefalosporinerna. MIC för aminoglykosiderna visade på minskad känslighet för nästan alla isolat. Aminoglykosidresistens på hög nivå (dvs. gentamicin > 1000 mg/L) hittades dock inte hos något av isolaten. Alla isolat var mottagliga för vankomycin. Rifampicin var det mest aktiva testade läkemedlet med ett MIC50 på 0,031 mg/L (intervall <0,004-0,064 mg/L), utom för ett isolat med ett MIC > 32 mg/L (upprepad testning). Aktiviteterna hos kinolonerna ciprofloxacin och sparfloxacin visade sig vara lika bra.

Dödande kurvanundersökningar

Genomsnittliga tidsdödande kurvor för varje försök presenteras i figuren. Enbart vankomycin (både 4 × och 10 × MIC) uppvisade bakteriedödande aktivitet mot stam B1. För penicillin hittades bakteriedödande aktivitet endast för 10 × MIC mot B8. För båda antibiotika var den bakteriedödande effekten långsam, dvs. den uppträdde först efter 24 timmar. Gentamicin var inte bakteriedödande – i de flesta experiment sågs tillväxt. Penicillin i kombination med gentamicin var synergiskt och var snabbt bakteriedödande för stam B8 i både P2G10 och P10G10. För stam B1 fann man dock endast en additiv och långsam bakteriedödande effekt. När vankomycin kombinerades med gentamicin fann man en snabb bakteriedödande effekt för båda stammarna. En synergieffekt kunde påvisas efter 3 timmar och 6 timmar för stam B8. Efter 24 timmar var dock vankomycins dödande aktivitet så uttalad att det inte var möjligt att påvisa en synergieffekt. För B1 hittades endast en additiv effekt. Inga antagonistiska effekter registrerades i något av experimenten.

Diskussion

Denna studie presenterar för första gången en utvärdering av MIC för en representativ panel av antibiotika mot ett stort antal isolat av A. urinae som erhållits från patienter med urinvägsinfektion, bakteriemi/septikemi och/eller endokardit. För att utvärdera användningen av antibiogram för taxonomiska ändamål har MIC för 15 antibiotika för 10 A. urinae-stammar undersökts tidigare,12 men detaljerade uppgifter har inte presenterats.

A. urinae är krävande organismer som kräver tillägg av blod i medierna och ibland inkubation i en CO2-berikad atmosfär och/eller en förlängd inkubationstid för att få tillräcklig tillväxt för att testa antibiotikakänslighet. Därför kunde stammarna inte testas med hjälp av standardförhållanden som beskrivs av BSAC eller NCCLS.13-15 Behovet av att ändra odlingsförhållandena är dock ett vanligt problem för fastiösa grampositiva bakterier.18,19A. urinae-isolat uppvisade ett antimikrobiellt känslighetsmönster som liknade det för α-hemolyserande streptokocker med endast små variationer i känslighet mellan isolaten. MIC för β-laktamer för isolaten låg typiskt sett inom fyra tvåfaldiga utspädningssteg, utom för cefalosporinerna ceftriaxon och cefepim, som uppvisade en större variation i MIC (tabell). På grund av det möjliga inflytandet av CO2-inkubering (sänkning av pH) bör försiktighet iakttas vid bedömningen av känsligheten för tetracyklin (överskattad känslighet) och erytromycin (underskattad känslighet). Bland de undersökta isolaten av A. urinae identifierades ingen höggradig resistens mot de testade aminoglykosiderna, vilket lämnar öppet för möjligheten av en synergieffekt när de kombineras med antingen en β-laktam eller vankomycin (se nedan). Enligt MIC finns det flera behandlingsalternativ för allvarliga infektioner eftersom isolaten var mottagliga för penicilliner, vankomycin och rifampicin (utom ett isolat). De utvalda kinolonerna, ciprofloxacin och sparfloxacin, visade också god aktivitet. Även om det är en kräsen organism har de resultat som erhållits med skivdiffusionsmetoder2,5,20 överensstämt med de MIC som presenteras i denna studie, vilket tyder på att ett tillförlitligt resultat kan erhållas med hjälp av dessa rutinmässiga känslighetsmetoder.

Riktlinjer för behandling av allvarliga infektioner som septikemi med eller utan endokardit bör optimalt sett baseras på klinisk erfarenhet i noggrant utformade studier, men detta är svårt när det handlar om sällsynta bakterier. Därför kan in vitro-studier som omfattar tekniker med dödande kurvor ge viktig information till klinikern i dessa fall.

Antibiotikakoncentrationer som kan uppnås in vivo valdes för experimenten. För gentamicin valdes en dos på 10 mg/L, vilket motsvarar den koncentration som erhålls vid dosering av 240 mg en gång dagligen (motsvarande 3-4 mg/kg).21 Dessutom, även om flera artiklar förespråkar dosering två gånger dagligen vid endokardit, är det i Danmark vanligt att gentamicin används en gång dagligen, på grund av minskad nefrotoxicitet och det faktum att synergieffekten med β-laktamantibiotika ökar med ökande aminoglykosidkoncentrationer.22 De data som erhölls i vår in vitro-studie av dödande kurvor för penicillin och vankomycin visade att varken penicillin eller vankomycin var bakteriedödande mot något av de två isolat som testades från patienter med infektiös endokardit. I kombination med gentamicin erhölls en bakteriedödande effekt mot båda isolaten för både penicillin och vankomycin. Lyckligtvis rekommenderas dessa regimer för behandling av infektiös endokardit av okänd etiologi i hela världen.23 Dödsfrekvensen för de två stammarna var olika, vilket tyder på att det kan finnas variationer mellan stammarna. Trots in vitro-känslighet för de antibiotika som gavs fann vi att prognosen var dålig för äldre patienter som lider av infektiös endokardit orsakad av A. urinae.8 De nuvarande resultaten för penicillin, gentamicin och netilmicin (MIC) stämmer överens med resultaten i den nyligen publicerade schweiziska rapporten av Zbinden et al.11 för två A. urinae-isolat från endokarditpatienter.

Behandlingsalternativen för A. urinae tycks innefatta penicilliner i mindre allvarliga fall. I allvarliga fall, dvs. endokardit, tyder time-kill undersökningarna på en fördel av att kombinera penicillin eller vankomycin med gentamicin. Hos penicillinallergiska patienter utgör vancomycin det mest uppenbara alternativet.

Tabell.

MIC för 14 antimikrobiella medel för A. urinae (n = 56)

Övre gränsen för mottaglighet för streptokocker enligt NCCLS15 eller SRGA16,17 markerad med grå skuggning.

aAntal stammar.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tabell.

MIC för 14 antimikrobiella medel för A. urinae (n = 56)

Övre gränsen för känslighet för streptokocker enligt NCCLS15 eller SRGA16,17 markerad med grå skuggning.

aAntal stammar.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L