The transwell migration assayは、科学者が細胞の動きを定量化することができる古典的な技術である。 移動とは、細胞が個々に、あるいは集団で移動する能力を指す。 細胞の動きは、細胞骨格の正確な再構築によって可能となり、移動は通常、合図として機能する刺激に反応して起こります。
本日は、合図を引き寄せることに反応して移動を評価する、簡単なチャンバー設定を利用したトランスウェル移動アッセイについてご説明します。
まず、トランスウェル チャンバーに関する背景情報を提供します。
この装置は、1961年にStephen Boyden博士が初めて設計し、白血球の移動を研究するために使用しました。 そのため、この方法はBoyden chamber assayとしても知られています。
単純なBoyden chamberでは、外壁は96ウェルプレートのもののようなウェルになっています。 各ウェルの中には、トランスウェルと呼ばれる円筒形のインサートが設置されている。 このインサートには、一定の孔径を持つポリカーボネート製のメンブレインが装着されている。 ウェルに入れると、チャンバーを2つのコンパートメントに分割する。 上のコンパートメントには移動行動を研究する細胞が播種され、下のリザーバーには化学誘引剤の溶液が置かれる。 化学誘引剤の定義は、「細胞を引き寄せる」ことによって細胞の運動を促進する能力を持つ分子である。
この引き寄せる力によって、上の区画の細胞は孔を通って下のリザーバーに移動する。 一部のメラノーマ細胞のように細胞が付着性を持っている場合、移動に続いて膜の下側に「付着」することになる。 この場合、メンブレンを固定し、染色し、顕微鏡で細胞を数えることができる。 一方、精子のように付着しない細胞は、下部のリザーバーに移動します。 この場合、リザーバー液中の細胞は血球計で数えることができます。
このアッセイの設定は簡単ですが、実験の前に考慮しなければならないことがいくつかあります。 そのいくつかをおさらいしておきましょう。
播種液から始めて、細胞の移動を観察するために密度が最適であることを確認する必要があります。 細胞が少なすぎると移動が検出されず、密度が高すぎると膜が過密になり、移動を列挙するのが難しくなります。 第二に、インサートのポアサイズについて検討します。 これは細胞の種類によって慎重に選ぶべきであ る。 ポアサイズが小さすぎると、細胞は通過することができません
あるいは、ポアサイズが大きすぎると、細胞はただ通り抜けてしまい、これは移動ではありません。 最後に、化学誘引剤の濃度と、遊走のために許されるインキュベーション時間について、これらは相互に依存しているため、留意しなければならない。 最適な濃度と適切なインキュベーション時間でコンパートメント間の濃度勾配を維持すると、化学吸引力により細胞の移動が誘発される。
これらのことを念頭に置いて、接着細胞の移動を測定するために使用されるプロトコルを説明しよう。プロテアーゼは重要な膜受容体を変性させ、最終的に移動に影響を与えるので、アッセイする細胞はプロテアーゼフリー培地で準備する。 細胞の調製後、懸濁液は最適な播種密度に希釈する必要があります。 チャンバーの準備のため、マルチウェルプレートのウェルにトランスウェルを設置します。 細胞懸濁液は、メンブレンに触れたり気泡が入ったりしないように、ピペットでトランスウェルに注入する必要があります。
化学吸着剤溶液を下部リザーバーにピペッティングし、溶液がインサートのメンブレンに接触することを確認します。 移動のためのインキュベーション時間は、実験の考慮事項に依存します。 インキュベーション後、70%エタノールに浸し、メンブレンを固定する。 インサートを乾燥させた後、細胞染色液を加える。
次に、細胞を室温で約30分間インキュベートする。 インキュベーションの後、インサートは洗浄バッファーの助けを借りて洗浄される。 最後に、メンブレンを切り取って、顕微鏡のスライドに載せることができる。
さて、プロトコルの感触をつかんでいただいたところで、研究者がこの方法をどのように使用しているか、簡単に見てみましょう。 ここでは、両生類の卵から分泌される物質であるアリューリンの存在下で、カエルの精子の遊泳経路を調べることに興味をもちました。 まず、活性のあるカエル精子をトランスウェルインサートの上部にピペッティングした。 そして、その底にアリューリンを加えた。 そして、細胞を移動させた後、リザーバー液中の精子を顕微鏡で数えた。
細胞は病原体に攻撃されると、化学誘引物質を送って免疫細胞を集め、移動して付着し、その後に感染を解決する。 この現象を調べるため、研究者たちは上皮細胞をインサートの下側で培養した。 そして、この細胞にさまざまな細菌を感染させた。 そして最後に、免疫細胞を上部のチャンバーに導入した。 感染した細胞は、免疫細胞の移動を誘導するいくつかの化学誘引物質を産生することが知られている。 この実験の結果、さまざまな種類の細菌感染に反応して、好中球の移動の程度が異なることが示されました。
最後に、細胞外マトリックスを介したがん細胞の侵入と転移は、常に細胞生物学者の興味を引いてきました。 ここでは、特定の化学誘引物質が、3Dマトリックスを介したこのような移動にどのように寄与するかを明らかにしたいと考えました。 研究者らは、緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質を発現する2つの細胞プールを遺伝子工学的に作製した。 そして、細胞外マトリックスを模したものをトランスウェルの上部に流し込みました。
いったん固まると、トランスウェルを反転させ、膜の下側に2つの細胞プールを播種しました。 次に、マルチウェルプレートに挿入物を入れ替え、化学吸引剤溶液を上部のチャンバーにピペッティングした。 すると、下部の細胞は3Dマトリックス内を上下に移動した。 共焦点画像の助けを借りて、これらの研究者は3Dで細胞の移動を再構築し、2つのグループの細胞の移動パターンを区別しました。
あなたは今、トランスウェル移動アッセイに関するJoVEのビデオをご覧になったところです。 この方法の構成要素とプロトコルを理解することで、なぜこの方法が細胞生物学者に広く利用されているのかがお分かりいただけたと思います。 シンプルなセットアップでありながら、様々なコンフィギュレーションに対応できるこの方法は、細胞の運動性研究には欠かせないものとなっています。 いつもながら、ご視聴ありがとうございました！
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