塩橋のタンパク質の折り畳み状態への全体の安定性への寄与は、突然変異誘発研究および核磁気共鳴技術から集められた熱力学データを通して評価することが可能である。 高pHでの沈殿を防ぐために特異的に変異させた擬似野生型タンパク質を用いて、点変異を行い、塩橋を変化させ、その結果、塩橋を壊すことによって、タンパク質の折り畳み状態の全体の自由エネルギーに対する塩橋の寄与を決定することができる。 例えば、T4リゾチームでは、残基70のアスパラギン酸（Asp）と残基31のヒスチジン（His）の間に塩橋が存在することが確認されている（図3）。 そこで、アスパラギン（Asn）を用いた部位特異的変異導入（図4）を行い、新たに3種類の変異体を得た。 Asp70Asn His31 (Mutant 1), Asp70 His31Asn (Mutant 2), Asp70Asn His31Asn (Double Mutant).
一度変異体が確立されると、塩橋に関連した自由エネルギーを計算するために2つの方法を採用することができる。 一つは野生型タンパク質の融解温度と三つの突然変異体の融解温度を観察する方法です。 変性は、円偏光二色性の変化を通してモニターすることができます。 融解温度の低下は、安定性の低下を示しています。 これは Becktel と Schellman によって説明された方法によって定量化され、両者の自由エネルギー差は ΔTΔS によって計算されます。 この計算にはいくつかの問題があり、非常に正確なデータでなければ使用できない。 T4リゾチームの例では、擬似野生型のΔSはpH5.5で報告されているので、このpHでの中点温度差11℃に、報告されているΔS360 cal/(mol-K) (1.5 kJ/(mol-K))を掛けると、約-4 kcal/mol (-17 kJ/mol) の自由エネルギー変化が得られることになります。 この値は、塩橋によってタンパク質の安定性に寄与した自由エネルギーの量に相当する。
第二の方法は核磁気共鳴分光法を利用して、塩橋の自由エネルギーを計算するものである。 カルボキシレート基またはアンモニウム基に隣接する炭素のプロトンに対応する化学シフトを記録しながら、滴定を行う。 滴定曲線の中点はpKa、すなわちプロトン化分子と脱プロトン化分子の比率が1:1となるpHに相当する。 T4リゾチームの例で続けると、ヒスチジン31のC2プロトンのシフトを観察することにより、滴定曲線が得られます（図5）。 図5は、野生型とAsp70がAsnである変異体との滴定曲線のシフトを示したものである。 脱プロトン化したAsp70とプロトン化したHis31の間に塩橋が形成されていることがわかる。 この相互作用によってHis31のpKaが変化する。 塩橋を形成していないアンフォールド状態の野生型タンパク質では、His31は中程度のイオン強度のH20緩衝液中ではpKaが6.8であると報告されている。 図5は、野生型のpKaが9.05であることを示している。 このpKaの違いは、His31とAsp70の相互作用によって裏付けられている。 塩橋を維持するために、His31はそのプロトンをできるだけ長く保とうとする。 変異体D70Nのように塩橋を破壊すると，pKaは6.9に戻り，アンフォールド状態のHis31のpKaに近くなる。 Gibbs自由エネルギー：ΔG = -RT ln(Keq)を用い、Rは普遍気体定数、Tはケルビン単位の温度、Keqは平衡状態における反応の平衡定数である。 His31の脱プロトン化は酸の平衡反応であり、特別なKeqは酸解離定数Kaとして知られています。 His31-H+ ⇌ His31 + H+となる。 そしてpKaはKaと次のような関係にある：pKa = -log(Ka)。 変異体と野生型の自由エネルギー差の計算は、自由エネルギーの式、pKaの定義、観察されたpKaの値、自然対数と対数の関係を用いて行うことができるようになりました。 T4リゾチームの例では、このアプローチにより、全体の自由エネルギーに対して約3kcal/molの寄与を計算で得ることができた。 同様のアプローチは、塩橋の他の参加者、例えばT4リゾチームの例ではAsp70について、His31の変異後のpKaのシフトをモニターすることによって行うことができる
適切な実験を選ぶ際の注意点は、タンパク質内の塩橋の位置である。 環境は相互作用に大きな役割を果たす。 高イオン強度では静電的相互作用が関与するため、塩橋は完全に隠されてしまうことがある。 T4リゾチームのHis31-Asp70塩橋は、タンパク質内に埋もれていた。 表面塩橋では、通常は動くことができる残基が、静電相互作用と水素結合によって制限されるため、エントロピーがより大きな役割を果たす。 このため、相互作用の寄与がほとんどなくなるほどエントロピーが減少することが示されている。 表面塩橋は、埋もれた塩橋と同様に、二重変異体サイクルやNMR滴定を用いて研究することが可能である。 埋もれた塩橋が安定性に寄与している場合もあるが、他のものと同様に例外も存在し、埋もれた塩橋が不安定化効果を示すこともある。 また、表面塩橋は特定の条件下で安定化効果を示すことがある。 安定化効果、不安定化効果はケースバイケースで評価しなければならず、一概には言えません
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