GyrB and GyrA expression and purification
完全長の大腸菌GyrA (2-875) をコードする配列は、N末端の10HisタグとC末端のTwin-strepタグを含む改変pET28bに挿入された。 過剰発現は大腸菌BL21 (DE3) pRARE2 で50 µg/mL kanamycin と35 µg/mL chloramphenicol を含むLB培地中で行った。 細胞はOD600 0.85に達した後0.35 mM IPTGで誘導し、37℃で4時間タンパク質を発現させた。細胞を回収して溶解バッファ（20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 10% v/v glycerol, pH 8.0 ）に再懸濁し、1500 barでEmulsiFlex-C3を使って3サイクルの高圧破砕で溶解させた。 GyrAタンパク質は、Ni2+イオンを結合したChelating Sepharose 6 Fast Flow樹脂（GEヘルスケア）を手動で充填したXK 26/20カラム（ファルマシア）でニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。 250 mM イミダゾール pH 8.0 を含む溶解バッファーで溶出を行い、溶出したタンパク質を 10 ml Streptavidin Sepharose (GE Healthcare) に直接付着させた。 タンパク質はStrepバッファ（20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8.0）で広範囲に洗浄し、3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich) を含むStrepバッファで溶出させた。 続いて、10-HisタグとTwin-strepタグの両方をPreScissionプロテアーゼ（P3C）とTobacco Etch Virus（TEV）の切断（質量比1：1：50 P3C-TEV-GyrA） により4 ℃で一晩切断した。 次に、GyrAを、HiTrap Q HPカラム（GEヘルスケア）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー工程によりさらに精製した。 このタンパク質は、バッファB（20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8.0）による20カラム容量の線形勾配で溶出された。 GyrAを含む画分をプールし、20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8.0を用いたSuperdex S200 16/60サイズ排除クロマトグラフィーカラム (GE Healthcare) にロードした。 3 Lの培養液から37 mgのGyrAを得た。 GyrB（2-804）コード配列を、同じ改変pET28bに挿入した。 大腸菌BL21（DE3）pRARE2において、50μg／mLカナマイシンおよび35μg／mLクロラムフェニコール含有LB培地中で過剰発現を行った。 細胞はOD600 0.85に達した後、0.35 mM IPTGで誘導し、18℃で18時間タンパク質を発現させた。GyrBの精製手順は、上記のGyrAについて述べた通りである。 3Lの培養液から10mgのGyrBを得た。
完全DNAジャイレース再構成
E. coli GyrAとGyrBを等モル比で混合して完全DNAジャイレース再構成を可能にした。 この複合体をさらにSuperdex S200 16/60 size-exclusion chromatography column (GE Healthcare) でcryo-EM buffer (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0.5 mM TCEP, pH 8.0) で精製した（図1、補足図参照）。 1）。
核酸調製
シグマ・アルドリッチから入手した2つのリン酸化非対称合成オリゴヌクレオチド12を用いてダブルニックの180 bp DNA二重鎖を再構成した（補足表1）。 簡単に言うと、核酸は1mMの濃度でDNAseフリー水に溶解させた。 二本鎖DNAを組み立てるために、各オリゴを1：1のモル比で混合し、95℃で2分間インキュベートした後、20℃に達するまで1分ごとに1℃ずつ温度を下げてアニーリングさせた。
低温電子顕微鏡のための複合体形成
精製したDNAジャイレースと180bp dsDNAを1：1のモル比で混合し、最終タンパク質およびDNA濃度を32μMとした。 この混合物を37℃で10分間インキュベートした。 100％DMSOに10mMで再懸濁したゲポチダシン（GSK2140944、MedChemExpressで購入）を最終濃度170μM（1.7％DMSO）になるよう添加した。 この混合物を37℃で10分間インキュベートした。 AMP-PNP (Sigma) を最終濃度340 µMで複合体に添加した。 完全に再構成された複合体は、さらに30℃で30分間インキュベートされた。 最後に、8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) を複合体に添加した。
Cryo-EM grid preparation
Quantifoil R-1.2/1.3 300 mesh copper gridは、4 µlの複合体を適用する前に20秒間グローチャージされました。 30秒間のインキュベーション後、Vitrobot mark IV (FEI) を用いてグリッドを液体エタン中で10℃、95%のチャンバー湿度で急冷却した。
電子顕微鏡検査
電子顕微鏡検査は、K2 Summit直接電子カメラ（Gatan）、スリット幅20e-Vのゼロエネルギー損失モードで作動するGIF Quantumエネルギーフィルター（Gatan）、Voltaフェーズプレート（FEI）およびCSコレクター（FEI）を備えた300kVで作動するTitan Krios顕微鏡（FEI）上で、クライオEMイメージングが実施された。 画像は、Serial EM53を用いたEFTEMナノプローブモードで、公称倍率13万倍、超解像ピクセルサイズ0.44 Å、デフォーカス目標-500 nmで記録した（補足図2c）。 VPPは100分ごとに新しい位置に進められた（Supplementary Fig.2b）。 検出器の線量率は6〜8e-/pixel/s（試料でのピクセルサイズは0.88Å）で4つのデータセットが収集された。 画像は、総線量50 e-/Å2、露光時間7〜10秒、サブフレーム0.2〜0.25秒（総フレーム数35〜50）で記録された。
データ処理
各データセットのデータ処理は、粒子が統合される3D精密化まで同じ手順で個別に行われた。 超解像線量分割されたサブフレームはIMOD54でゲイン補正され、フーリエクロッピングで2回ビニングされ、MotionCor255でドリフト補正、線量重み付けされ、0.88Åピクセルサイズの合計画像を得た。 補正後の顕微鏡写真のコントラスト伝達関数は、GCTF v1.0656を使用して推定した。 非点収差を手作業で検査し、4Åより悪い解像度を持つ顕微鏡写真を破棄し、8,701枚の顕微鏡写真が残った。 粒子は、RELION229,30の参照不要のガウスブロブピッキングプロトコルによって自動的にピックされた。 4つのデータセットを合わせて、合計1,572,962個の粒子が選択された。 各データセットから4回ビン詰めした粒子を、RELION2で2回の2次元分類を行い、ジャンクパーティクルや汚染物を除去した結果、合計479,667個の粒子がさらに処理されることになりました。 4つのデータセットからの粒子は、1つのデータセットにマージされ、その後、3×3のビニングされたフォーマットでセンタリングしながら再抽出が行われました。 そして、2次元分類の最後のラウンドが行われ、338,616個の粒子からなる最終的な粒子スタックが生成されました。 この粒子スタックは、cryoSPARC31で3D ab-initio分類を1ラウンド行いました。 質の悪いモデルを破棄した後、残りのab-initioモデルは、クラス確率の閾値を0.9として、191,456粒子の最終データセットとなった（補足図2a）。 このab-initioモデルは30Åにローパスフィルターされ、cryoSPARCでの均質な精密化のためのリファレンスとして使用され、5.4Åのマップが作成されました。 精製された粒子座標は、GCTF v1.06を用いた局所的なCTF推定に用いられ、その後、センタリングされた2×2ビン化粒子の再抽出が行われました。 この新しい粒子スタックをRELION2で3次元自動精密化し、30Åでローパスフィルターをかけたab-initioモデルを用いて、グローバル解像度5.0Åのマップを得た（補足Fig.3）。 局所分解能は、DNA結合/切断コアで4.0Å、ATPaseドメインとDNAを包むGyrA β-pinwheelで9.0Åの範囲を示し、これら二つのモジュールの高い柔軟性が示唆された。 各ドメインの密度が明確に定義された完全な複合体の最終的な再構成を得るために、アライメントを行わない3次元分類を行い、いくつかの異なるクラスが得られた。 3つのクラスからの粒子を統合した（94,633粒子）。 その後、1×1ビンの粒子スタックをRELION2で精製した。精製の後半に解像度を上げるためにソフトマスクが適用されるまで、マスク無しで精製した。 このマップの後処理により、複合体全体の6.6Å分解能の再構成が得られた（補足図3）。
異なるコンフォーメーションの特定と各ドメインの局所分解能を改善するために、異なる局所アプローチの組み合わせが用いられた。 ATPaseドメインは3Dフォーカス精密化には小さすぎたため、まずRELION2でソフトマスクとアライメントなしでATPaseドメインのフォーカス3D分類を実行した。 ATPaseドメインの密度が明確に定義された58,329個の粒子からなる1つのクラスが選択され、その後、1×1ビン化された粒子の再抽出を行い、0.88 Å/ピクセルのピクセルサイズの粒子が得られました。
次に、GyrAβ-pinwheelの3次元分類を、RELION2でソフトマスクを用い、アライメントを行わずに行った。 GyrAβ-pinwheelの密度がよくわかる45,040個の粒子を1クラスとし、1×1ビンで再抽出したところ、0.88Å/pixelの粒子が得られた。 このクラスをRELION2でβ-pinwheelとDNA-binding/cleavage domainの周りにソフトマスクを用いてさらに絞り込み、6.3Å分解能のマップを得た（補足図3）
最後にRELION2でDNA binding/cleavage domainの周りにソフトマスクを用いて重点的に3次元自動絞り込みを実施した。 このマップの後処理により、DNA結合/開裂領域の4.3Å分解能での再構成が行われた。 次に、DNA結合/開裂領域の3D分類が行われた。 その結果、2つのクラスがより良い角度精度を示し、DNA結合/開裂ドメインの閉じた状態（60,548粒子）と開裂前の状態（53,655粒子）が明確に示されました。 これらの2つのクラスは、RELION2において、1×1ビンの粒子を用いたC2対称の3次元精密化により、後処理後にそれぞれ4.0と4.6Åのグローバル分解能の再構成を得た（補足図3）。 閉じたDNA結合/切断ドメインは、ソフトマスクを用いた3次元精密化により、乱れたTOPRIM挿入部を除いた4.0Åの高品質なマップが得られた（補足図3）。
報告されたすべての解像度はゴールドスタンダードFSC-0.143基準57に基づき、FSC曲線はcryoSPARCと同様にRELION2で高解像度ノイズ置換58を用いてソフトマスクのコンボリューション効果について補正された(補足図4a). すべての再構成は、自動化された手順で推定された負のB-factorを適用することによって鮮鋭化された59。 マップの局所分解能はBlocres60を用いて計算した（補足図4c）。 複合体全体、ATPaseコア、CTDコア、DNA結合/切断ドメインの閉じた状態（TOPRIM挿入あり/なし）および開口前の状態の低温電子顕微鏡マップは、それぞれEM Data Bankにアクセッション番号EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912として寄託されている。
モデル構築と精密化
4.0Åで解いたTOPRIM挿入部を欠くDNA結合/切断ドメインのEM再構成は最高の品質であった。 ほぼすべての側鎖を見ることができ、Gepotidacinの密度もはっきりと確認できた。 このマップは、大腸菌のDNAジャイレース17のDNA結合/切断ドメインの結晶構造を精密化するために使用された。 DNA結合/切断ドメインの二量体原子モデルは、PyMol (Schrodinger L.L.C.) のPDB 3NUHを用いて作成された。 その後の原子モデルは、TOPRIM挿入に属するアミノ酸、すべてのイオンおよび水分子を除去し、すべての占有率を1に設定し、B-因子を50に設定した。 まず、原子モデルは、Chimera61でフィルタリングされシャープにされたマップに剛体フィッティングされました。 PHENIX62 で、局所的な実空間フィッティングとグローバルな勾配駆動最小化精密化を用いて、実空間精密化の第一ラウンドが実行されました。 次に、S. aureus DNA gyrase41 (PDB 5IWM) の構造から20個の核酸をコピーし、我々の原子モデルにフィッティングした。 DNAの配列は、私たちの構造で使用されているDNAに合わせて修正しました。 不足するタンパク質残基と核酸は COOT63 で手作業で構築した。 Gepotidacin (GSK-2140944) の原子モデルおよび制約辞書は，Grade サーバー (http://grade.globalphasing.org) で作成しました． Gepotidacinは、COOTの空の電子密度に手動でフィットさせ、その後、複製を行った。 複製はいずれも0.5占有に設定された。 二次構造、ロータマー、ラマチャンドラン、および非結晶学的対称性の拘束を用いたPHENIXでの実空間精密化を、収束するモデルが得られるまで、常にCOOTでの手動検査に続いて数ラウンド実行した。 最後に、Bファクターは、前と同じ設定を使用して、PHENIXの実空間洗練の最終ラウンドによって洗練されました。 精密化が収束した後、TOPRIM挿入の原子座標が原子モデルに追加された。 さらに、閉じた状態と開いた状態での挿入体密度を含むEM再構成において、同じ手順で精密化を行った。 ハーフマップクロスバリデーションを行い、PHENIXの最適な精密化重量を1.5とし、原子衝突の低減とモデルのオーバーフィッティングの防止を可能にしました（補足図4e）。 すべての精密化ステップは、ゴールドスタンダードFSC-0.143基準57に従った再構成の分解能限界を使用して行われた。 精緻化パラメータ、モデルの統計量、検証スコアを補足表2にまとめている。 大腸菌のDNA結合/切断ドメインの閉じた状態（挿入あり、なし）および開口前のコンフォメーションの原子モデルは、それぞれアクセッション番号6RKU、6RKS、6RKVでProtein Data Bankに寄託されている
複合体全体については、異なるEM再構成を組み合わせてDNAジャイレース全体複合体の原子モデルを構築した。 5.9Åで解いたATPase-Core構造を用いて、ATPaseドメインとADPNP32（PDB 1EI1）の複合体結晶構造およびDNA結合/切断ドメインを閉鎖状態で精製したものをChimeraで剛体化した。 電子密度の高さから、ATPaseドメインとDNA結合/切断ドメインの間のリンカーに欠けている残基をCOOTで構築することができました。 6.3Åで解かれたCTD-Core構造は、Chimeraでβ-pinwheel結晶構造10を正確にリジッドボディフィットするために使用されました。 GyrA-boxに続く10個の欠損アミノ酸（564-574）は、モデリングサーバPhyre264を用いて追加した。 電子密度の高さにより、β-ピンホイール周辺の欠落した核酸と、最後のGyrA残基をβ-ピンホイールにつなぐ10個のアミノ酸をCOOTで構築することができた。 二次構造予測に基づき、リンカーの一部はαヘリックスとして構築された（図3）。 ATPaseドメイン、DNA結合/切断ドメイン、1つのβ-ピンホイールを含む後続の原子モデルを、Chimeraを使って6.6Åで解いた全体複合体構造にリジッドボディフィッティングした。 次に、1つ目のβ-pinwheelのコピーをCOOTで2つ目のβ-pinwheelの密度にフィットさせた。 2番目のβ-pinwheelの周りの欠損した核酸とリンカーの欠損した10残基は、COOTで手作業で構築された。 得られた原子モデルから、すべてのイオンと水分子を取り除き、すべての占有率を1に、B-factorを50に設定した。 最後に、 PHENIX で剛体およびグローバル勾配駆動最小化法を使用して、 複合体構造全体に対する原子モデルの実空間精密化を行いました。 精緻化の分解能の限界は、ゴールドスタンダードである FSC-0.143 基準57 に従って設定されました。 ハーフマップ交差検証も行った（補足図4e）。 精密化パラメータ、モデルの統計量、検証スコアをSupplement Table 2にまとめました。 全体構造の原子モデルはProtein Data Bankにアクセッション番号6RKWで寄託されています。 全ての図はChimera61, ChimeraX65, PyMol (Schrodinger L.L.C.) で作成した。
E. coli GyrB R286K, R286Q, E264A purification
Wild-type E. coliのGyrBに使った改変pET28bは、E. coliのR286K、R286Q、およびE264A精製に使用したもので、E. coliのR286K、R286Q、およびE264A精製に使ったものである。 coli GyrBの過剰発現に用いた改変pET28bをQuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit（Agilent）を用いて部位特異的変異導入し、R286K, R286Q, E264A変異を有する3種のプラスミドを作製した（付表4）。 この3種の変異体の過剰発現および精製手順は、上記の方法論の項で述べた野生型GyrBと同じである。
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q purification
野生型に用いた改変pET28bはT. thermophilus GyrB の過剰発現12 に用いた改変 pET28b を QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) を用いて部位特異的変異導入し、K284R または K284Q 変異導入プラスミドを作成した（補足表 4）。 この2つの変異体の過剰発現および精製手順は、上記の方法セクションに記載した大腸菌野生型GyrBと同じである。
DNAスーパーコイリングアッセイ
増加濃度のDNAジャイレース（GyrA2B2）を、20mM Tris-acetate pH 7.9, 100mM potassium acetate, 10mM magnesium acetate, 1mM DTT, 1mM ATP, 100μg/ml BSAを含む反応混合物中、6 nMの緩和なpUC19プラスミドとともに37℃でインキュベートした。 30分後、1% SDSの添加により反応を停止した。 アガロースゲル電気泳動を用いて、弛緩したpUC19のスーパーコイル形態への変換をモニターした。 サンプルは0.8％アガロース、1X Tris Borate EDTA buffer（TBE）ゲル上で、6V/cm、室温で180分間泳動した。 アガロースゲルを1X TBE中の0.5 mg/ml エチジウムブロマイドで15分間染色し、その後5分間水中で脱染した。 DNAトポイソマーはTyphoon (GE Healthcare)を用いて明らかにした。
ATPase活性アッセイ
ATP加水分解は、ピルビン酸キナーゼ（PK）と乳酸脱水素酵素（LDH）を介したNADHの酸化を追うことにより測定される。 吸光度は島津製作所1700分光光度計を用いて37℃、600秒かけて340nmでモニターした。 反応は、50 mM Tris HCl pH 7.5、150 mM酢酸カリウム、8 mM酢酸マグネシウム、7 mM BME、100 µg/mgのBSA、4U/5UのPK/LDH混合物、2 mM PEPおよび0を含むバッファーの500 µl中、GyrA2B2および16 nM線形DNA (pCR-blunt) の3連で記録された。2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sequences from 30 species (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens.の30種のGyrB ATPase/Transducerタンパク質配列。 Q83FD5_COXBU：Coxiella burnetii；GYRB_ECOLI：大腸菌；GYRB_NEIGO：淋菌；GYRB_SALTY：サルモネラ チフィムリウム。 Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE、Pseudomonas aeruginosa、Q18C89_PEPD6、Clostridium difficile；GYRB_RICFE、Rickettsia felis；Q8CZG1_YERPE、Yersinia pestis；GYRB_BORBU。 Borrelia burgdorferi；GYRB_ENTFA、Enterococcus faecalis；Q8YEQ5_BRUME、Brucella melitensis；GYRB_STAAU、Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL、Blochmannia floridanus；GYRB_HAEIN、Haemophilus influenzae；GYRB_MYCTU、Mycobacterium tuberculosis、GYRB_THEMA、Thermotoga maritima; GYRB_THET8、Thermus thermophilus、GYRB_BACSU、Bacillus subtilis、GYRB_HELPY、Helicobacter pylori、GYRB_CHLTR、Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus）をClustal Omegaサーバー（EMBL-EBI）を用いて整列させた。 その後のアラインメントは、ConSurfサーバー（http://consurf.tau.ac.il）を用いて、ATPase/transducer構造（PDB ID 1EI1）上にアミノ酸の進化的保存性をプロットするために用いられた。 系統樹はClustal Omegaのマルチプルアライメントを用いてneighbor-joining法により作成した。
報告概要
研究デザインに関するさらなる情報は、この論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryで入手可能である。