Subjects
This study involving 88 treatment-neveve LC patients without distant metastasis.The Study of Lyngal cancer. 全例が検体の病理検査により喉頭扁平上皮癌と診断され，2008年1月から2017年12月までに琉球大学耳鼻咽喉科・頭頸部外科で治療を受けた患者である。 2018年7月に患者さんの最終的な予後を判定しました。 腫瘍、リンパ節、転移（TNM）ステージの分類は、AJCCステージングマニュアル（第7版）に従って実施した。 臨床病期の判定と併発する多発性原発がんの検出のため、上部消化管の身体検査および内視鏡検査、頸部の超音波検査、コンピュータ断層撮影（CT）、18F-フルオロデオキシグルコース-ポジトロン断層撮影CTイメージングを行った＜1119＞＜2949＞この研究は琉球大学施設審査委員会の承認を得て、2008年に改訂した「ヘルシンキの宣言をもとに1975」に従って行われたものである。 登録前にすべてのLC患者からインフォームドコンセントを得た。
治療
治癒を目的とした原発巣に対する主要治療は、HPVの有無にかかわらず、T1では従来の放射線治療（RT）単独またはレーザー切除、T2では同時化学放射線治療（CCRT）、T3ではCCRTか手術、T4では手術であった。 結節性病変はCCRTまたは頸部郭清と原発病変の切除を併用して管理した。 RT（総線量70Gy）を受けた全患者は、マスク固定による治療体位でCT支援三次元放射線治療計画を行った。 CCRTのプロトコルは既報の通りである。 39.6Gyの照射で頸部リンパ節の反応にかかわらずT3の原発巣が部分奏功しなかった場合、頸部郭清を併用して原発巣の根治手術が施行された。
HPV検出とp16免疫組織化学
放射線・化学療法を行わない原発病変の全組織試料について、生検または外科切除時に得られた新鮮凍結試料を用いたHPV DNA検出とFFPE試料によるp16免疫組織化学のPCR（ポリメラーゼ鎖反応）で解析を行いました。 PCRでHPVが陰性でp16が過剰発現している症例（陽性細胞75％以上，染色強度中程度以上）には，HPV DNAプローブを用いたin situ hybridization（ISH）によりHPVの状態をさらに評価した（DNA ISH）。 HPV-16を保有する症例では、以下に述べるウイルス量と身体的状態に関する定量的リアルタイムPCR（qPCR）が実施された。
HPV DNA検出のためのPCR
簡単に言えば、Gentra Puregene Tissue Kit（QIAGEN, Germantown, MD）で腫瘍試料からDNAが分離された。 DNAの存在と完全性は，プライマーPC04とGH20を用いたPCRβ-グロビン遺伝子増幅によって，すべての試料で確認された。 一般的なコンセンサスプライマーセットであるGP5+/GP6+とMY09/MY11を使用して、前述のようにPCRによるHPV DNAの存在を分析した（表1）。 さらに、GP5+/GP6+またはMY09/MY11のPCRで陰性となったDNAサンプルは、GP5+/GP6+プライマーペアを用いたnested PCRアプローチで再増幅された。 予想されるサイズのPCR産物（GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp）を精製し、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) で直接配列決定した。
p16 immunohistochemistry
p16の免疫組織化学はCINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Germany) を用いてメーカーのプロトコルに従って実施した． 免疫標識は3,3′-diaminobenzidineでインキュベートして可視化し、染色したスライドはhematoxylinで対比染色した。
本研究で用いたp16免疫反応性のスコアリング基準は以下の通りである。 0、染色なし；1、1〜< 25%の腫瘍細胞がp16に陽性；2、25〜< 50%陽性；3、50〜< 75%陽性；4、≥75%陽性かつ弱い染色強度；および5、≥75%陽性かつ少なくとも中程度の染色強度を有する。 p16過剰発現」（p16陽性）は、本研究ではスコア5と定義した。
ISH with HPV DNA probes
Biotinyl tyramide-based ISHは、製造者のプロトコルに従ってGenPoint™ HPV biotinylated DNA probeおよびGenPoint tyramide signal amplification system for biotinylated probesを用いて実施した（Dako; Agilent Technologies, Inc.） GenPoint HPVビオチン化DNAプローブは、FFPEサンプルの4μm厚切片中のHPVタイプ16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68と反応する。 ハイブリダイズしたプローブの検出は、製造元のプロトコールに従って、GenPoint検出システムを使用し、含まれる一次ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、ビオチニルチラミド、二次ストレプトアビジン-HRPおよび3，3´-ジアミノベンジジンl（Dako；Agilent Technologies）を用いて実施した。 HPV-16のウイルス量と身体的状態を評価するために、qPCRは前記のように行った。 HPV-16のE2およびE6 open reading frameを標的としたプライマーとTaqManプローブを使用した（表1）。 プライマーとプローブは、HPV-16の統合時に削除されるE2ヒンジ領域を認識する。 E2およびE6遺伝子についての2つの標準曲線は、完全なHPV-16初期遺伝子領域を有する、カール・マンガーからの贈り物であるpB-アクチン初期プラスミド（Addgeneプラスミド＃13711；Addgene、ケンブリッジ、MA）の10倍連続希釈（101、102、103、104、105および106ウイルスコピー）の増幅によって作成された。 ウイルスDNA負荷は、E6コピー数を計算することによって評価した。 細胞DNA定量化のために、ヒトゲノム胎盤DNA（Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany）の既知の連続希釈液（0.3、3、30、300ng）を用いて外部標準曲線を作成し、β-グロビンは前記のように増幅させた。 Cq値を標準曲線の対数に対してプロットすることによりDNA量を算出した。 HPV-16の身体的状態は、以前に発表された方法に基づいて評価した 。 E2/E6 ratio ≥ 1 はエピソーム型が優勢であることを示し、E2 copy number/total E6 < 1 は統合型とエピソーム型の両方が存在すること（混合型）を示す。 RNAiso Plus（タカラバイオ、日本、草津）を用いて、製造者の指示に従って凍結組織からTotal RNAを抽出した。 Total RNA（500 ng）を用いて、PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time; Takara Bio）を用いて、製造元の指示に従って一本鎖cDNAを合成した。 HPV-16 E6 mRNAの発現を測定するために、CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) と TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA) を用いてqPCRを実施した。 HPV-16 E6遺伝子とβ-actin遺伝子を標的としたプライマーとTaqManプローブ（表1）を使用した。 β-actinプローブは，5末端をFAM，3末端をTAMRAで標識した（Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan）． 増幅条件は以下の通りである。 増幅条件は，50 ℃で2分，95 ℃で10分，95 ℃で15秒，60 ℃で60秒の2段階サイクルで合計40サイクルであった． E6およびβ-アクチン遺伝子について、pB-アクチン初期プラスミドおよびβ-アクチンの完全なコーディング領域を有するpCAG-mGFP-アクチンプラスミド（安田良平から贈られた、Addgeneプラスミド# 21948; Addgene）の連続10倍希釈（101、102、103、104、105および106コピー）の増幅によって2つの標準曲線を生成させた。 各サンプルにおけるE6遺伝子の発現は、内部コントロールβ-actinの量によって正規化した。
HPV-16/- 18 E6/E7 mRNAのRNA ISHは、RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) を用いて製造者の説明書に沿って行われた。 簡単に言えば、FFPEサンプルの厚さ4-μmの連続切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的アルコールシリーズを使用して再水和した。 内因性ペルオキシダーゼをRNAscope® Hydrogen Peroxide Reagentで10分間、室温でブロックした。 ターゲットHPV RNAの回収は、RNAscope® Target Retrieval Reagentで、100℃、15分間行った。 スライドをRNAscope® Protease Plusで40 ℃、30分間消化した。 HPV-16/- 18 E6/E7 RNA probe (RNAscope® Probe-HPV16/18)を切片に加え、カバースリップを貼った。 その後、カバースリップを取り除き、40℃のRNAscope® Wash Buffer Reagentでスライドを洗浄した。 シグナル増幅は、メーカーの説明書に従って行った。 3,3′-diaminobenzidine (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit)を用いてハイブリダイズしたプローブの検出を行った。 スライドはヘマトキシリンで対比染色した。 RNA ISHには、陽性対照スライド（HPV-18 E6/E7 mRNAを発現するHeLa細胞）が含まれる。 陽性染色は、核および/または細胞質で見られる茶色の点状ドットとして識別された。
統計解析
ピアソンのカイ二乗検定は、HPV DNAおよびp16過剰発現状態によるLC患者の特徴を比較するために使用した。 累積生存期間（CS）はKaplan-Meier法を用いて算出し，log-rank検定を用いて2群間で比較した。 すべての解析はSPSS Statistical Package（SPSS、バージョン25.0；SPSS、IBM Corp.、Armonk、NY）を用いて実施された。 P < 0.05を有意とした。
0.05を有意とした。