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COMMENTARY

Dye exclusionはシンプルかつ迅速に細胞の生存率を測定できる技術ですが、生存率が細胞膜の完全性から間接的に決定されているという問題がありました。 そのため、膜の完全性が（少なくとも一過性には）維持されていても、細胞の生存率が（成長または機能する能力によって）損なわれている可能性があります。 逆に、細胞膜の完全性に異常があっても、細胞は自己修復して完全に生存できるようになる可能性がある。 もう一つの潜在的な問題は、色素の取り込みを主観的に評価するため、細胞の損傷を示す少量の色素の取り込みが見過ごされる可能性があることである。 この点に関して、蛍光顕微鏡を使用して蛍光色素で色素排除を行うと、透過型顕微鏡を使用してトリパンブルーで行ったテストよりも多くの非生細胞が色素取り込みでスコアリングされることが日常的になっています

細胞生存率を測定するより高度な方法は、フローサイトメトリによる色素排除を決定することです。 このタンパク質はタンパク質に結合し、フローサイトメーターで検出可能な蛍光シグナル（ウシ血清アルブミンに結合した場合は660 nm）を発するので、タイパンブルーを用いて行うことができる（フローサイトメーターにおけるトリパンブルーの使用に関する詳細は、文献2を参照のこと）。 あるいは、ヨウ化プロピジウムのような他の発光色素を用いて排除を測定することもできる（フローサイトメトリー解析による細胞生存率のヨウ化プロピジウムの使用評価については、ユニット 5.4 を参照）。 トリパンブルー排除法を用いた生細胞と死細胞の推定を、ここに述べたように手動で評価した場合と、フローサイトメトリーで電子的に評価した場合の詳細な比較から、この2つの技術は熟練した技術者であれば非常によく似た結果を得られることがわかります。 色素排除法はオペレーターの主観による誤差が生じやすいのに対し、フローサイトメトリー法は複雑で時間のかかる細胞精製技術を行う際の細胞生存率の評価にはあまり適していない。 このため、フローサイトメトリー法は、細胞混合物中の死細胞数の正確な測定が必要な場合にのみ適用される。

最近では、マイクロチップを搭載した携帯型顕微鏡セルカウンターで生細胞と死細胞をカウントする装置と組み合わせて、ヨウ化プロピジウムを用いて細胞の生存率を調べる「自動蛍光顕微鏡生死判定」が報告されている。 このカウンターは、今回紹介した手作業やフローサイトメーターよりも迅速に細胞生存率を評価でき、より正確で信頼性の高いカウントを得ることができるとされている。 この装置は、細胞生存率の迅速な測定が数多く求められる状況で有用であろう（3）。

DNAに結合する色素（エチジウムモノアジド）、ホスファチジルセリンに結合する薬剤（アネキシンV）、アミン反応性色素でも細胞生存率を評価できることに注意する必要がある。 これらの代替薬剤の使用には通常フローサイトメトリーが必要であり、したがって特定の条件下でのみ適用可能です。

Trypan blue exclusionは、上記のプロトコルで説明したように5～10分で行うことができます

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