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Case presentation

本症例報告は、メキシコ、ハリスコ州、サポパン市テシスタンにある2品種（ペリフォークとブラックベリー）の羊から成る155匹の農場の定期獣医訪問から得られたものである。 この農場の施設は、以前からある養豚場を改修したもので、現在も近隣に養豚場や牧場を抱えている。 群れは洗浄と取り扱いを容易にするために高床式で飼育されているが、ペンには多くの焙焼された鋭利なもの（ワイヤー、壊れたフェンス、釘など）が存在し、検査時には農場内で洗浄が適切に実施されていなかった。 飼料は、低質の粗飼料、豚の糞尿サイレージ、高タンパクの市販濃厚飼料など、現地で入手できるものを使っていた。 この農場では、動物に頻繁に皮膚膿瘍が見つかったため、獣医サービスを呼び出したが、皮膚疾患に関する他の苦情は報告されていない。 膿瘍は動物の生産性に影響を与えないようであるが、そのような病変の存在は動物の販売に悪影響を及ぼすため、オーナーはこの病気を農場から取り除くために、病因と推奨される治療法について知りたいと考えていた。 この問題を引き起こしている病因を見つけるために、認定獣医師が31頭（雌牛29頭、雄羊1頭、子羊1頭）から膿瘍の中身を採取し、細菌学的診断のために研究所に送った。 膿瘍の外観から、この農場での感染症の推定診断は、ほとんどの動物でCaseousリンパ節炎であった。 しかし，細菌学的解析の結果，13頭がC. pseudotuberculosis，1頭がCorynebacterium spp.，2頭がProteus spp.，2頭がStreptococcus spp.であり，残りの13頭は病原体が特定できないことが明らかとなった． Corynebacterium spp.分離株の分類は，細菌学的・生化学的検査の結果が結論に至っていないため不明であった。

本稿では，体調良好な4カ月齢のPelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) 子羊からC. xerosisを分離したことを報告した。 C. xerosisが羊に臨床的な皮膚膿瘍を形成した報告は，我々の知る限り今回が初めてである。 写真資料を含む臨床研究結果の公表について、動物の所有者からインフォームド・コンセントを得た。 この動物は左頚部に排膿のない硬い膿瘍を呈していた（Fig.1a）。 初期臨床診断では、C.pseudotuberculosisによるカゼ性リンパ節炎と診断された。 膿瘍の表面を洗浄・消毒後，滅菌した20ゲージ皮下注射針を用いて5mlシリンジで穿刺し，細菌学的分析用サンプルを採取した。 回収された滲出液の種類は、漿液様で外観は白色であった。 生物学的試料は、Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15.5 Toluca-Atlacomulco road, Toluca, Mexico, z.c. 50200) で生物学的特性評価が行われるまで4℃で保存された。 サンプルは8 %羊血液寒天培地で二重に培養し、好気性および微好気性条件下で37℃、24〜48時間培養した。 直径1.0 mm、非溶血性、黄褐色、やや乾燥した外観のコロニーが観察された（Fig. 2a）。 これらの形態的特徴は、これまで報告されているC. pseudotuberculosisの形態的特徴とは一致せず、むしろC. xerosisのコロニーと思われた。 顕微鏡で見ると（10倍拡大、Fig. 2c）、菌は棍棒のように先が尖った多形で、不規則に染色されたグラム陽性桿菌として観察された。 生化学的検査では，以下の結果が得られた。 三糖鉄（TSI），リジン鉄寒天（LIA），クエン酸試験（CIT），硫化インドール運動性（SIM），運動性，インドール，オルニチン（MIO），酸化発酵性（OF），メチルレッド（-）． ペプトン水（-）、ボーガー・パスカジェ（-）、尿素（-）、硝酸塩ブロス（＋）、トレハロース（＋）、スクロース（＋）、マルトース（＋）、グルコース発酵（37℃では陽性、42℃では陰性）。 これらの結果はC. pseudotuberculosisのプロファイルと一致する可能性があるが、尿素テストは陽性ではなく陰性であったため、C. xerosisのプロファイルと一致する可能性が高い。 診断結果は決定的なものではなかったが、APIシステムがC. xerosisの同定に特異的でないとしても、この分離株が他のCorynebacterium種と同定できるかどうか、このシステムで検討することにした。 さらに、本菌がC. freneyiやC. amycolatumのような羊でまれに見られる他の種に属するかどうかを調べるために、本コロニーが20℃で増殖できるかどうか、42℃でグルコース発酵ができるかどうかをテストした。 その結果、20℃では問題なく生育し、42℃ではグルコースを発酵しなかった。この2つの特徴は、C. xerosisとC. hanseniiに関連する。そこで、分離株をC. xerosisと分子的に同定できるかどうかを調べるために、分子解析を実施することにした。 診断の精度を上げるために3つの遺伝子座を分析した。 C. xerosisには通常存在しないが、C. pseudotuberculosisには存在する遺伝子、pld遺伝子を検査したところ、PCR検査の結果、C. xerosisであればアンプリコンが検出されないことが予想された。 第二の遺伝子座は、16S-23S rRNA遺伝子の遺伝子間スペーサー領域（16S-23S）の増幅を対象とし、C. xerosisでは機能しないことが報告されているC. pseudotuberculosis用に設計したプライマーを用いて、C. xerosisでは増幅バンドがなく、C. pseudotuberculosisでは816bpバンドがあると予想されるものであった。 最後に、Corynebacterium の種を区別することが報告されている rpoB 遺伝子 (446 bp) の PCR 増幅と塩基配列の決定を行った。 DNA抽出は市販のキット(KAPA Express Extract)を用い、メーカーのプロトコールにしたがって行った。 pld, 16S-23S, rpoB遺伝子の部分配列増幅のためのMultiplex-PCR法は、Pachecoが2007年に発表したプロトコルを用いて実施した。 反応は市販のMultiplex PCRキット(QIAGEN Multiplex PCR)を用いて、製造元の仕様書に従って行った。 PCR 分析には以下の試料を用いた。 PCR 分析には、特徴づけを行う分離株、C. xerosis と推定される分離株、および対照として使用する 2 種類の C. pseudotuberculosis (biovar ovis として以前に特徴づけられた地元の分離株と、参照株の ATCC 43924, biovar equi)が含まれる。 C. xerosisの予想通り、rpoB遺伝子断片に相当する単一のPCR 446 bpアンプリコンバンドが増幅され、遺伝子間16S-23S遺伝子およびpld遺伝子断片は増幅されなかった。 また、予想通り、C. pseudotuberculosisの両株は、それぞれpld、rpoB、16S遺伝子に対応する203、446、816 bpの3つのバンドを示した（Fig. 3）。 3つのサンプルのRpoB遺伝子アンプリコンはPromega社の精製キット（Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System）を用いて精製し、Macrogen社（Rockville, MD, USA）による自動シーケンシングに回された。 Mega 6.0.6のClustal W解析により、BLAST（NCBI）から得られた多重配列アライメントを本菌の配列とともに解析した（図4）。 系統解析はneighbor-joining法(MEGA software 6.0.6)を用いて行った。 ブートストラップ値は1000本のランダムツリーを生成して求めた。 系統解析には、C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2) からのrpoB遺伝子の配列も含まれた。 また、Corynebacteriumの特定の種に対応する異なる系統群を観察することが可能であった。 これらの結果から，本研究で分離されたC. xerosis（rpoB C53）はC. xerosisであることが確認された（図4）。

本研究で分離したrpoB C53株の配列解析に加えてPCRなどのジェノタイピング技術は、表現型の顕微鏡的・生化学的特徴からでは誤解されがちだった正しい種の同定に大きく貢献したと考えられる。 Corynebacterium xerosisは、これまでにヒトの臨床サンプルにおいて、心内膜炎、肺炎、骨髄炎、皮膚感染症の病変で、特に免疫不全の患者において報告されている 。 また、動物の臨床検体でも、例えばヤギの肝臓病変（偽結核の疑い）や、乳房炎を呈している動物の牛乳から検出されています。 豚では、肝臓、腎臓、肺、脾臓、関節などの様々な組織の病変から、また皮下膿瘍からC. xerosisが分離されています。 さらに、C. xerosisは、流産の症例における子宮のヒツジ臨床サンプルと、呼吸障害を呈する動物の肺組織から分離されている。 これらの分離株はPCR-RFLPを用いたrRNA 16S-23S遺伝子の増幅によって同定され、その特徴が明らかにされた。 しかし、これらの研究では、C. xerosisと他のCorynebacterium種を区別できるほど明確なバンドパターンを得ることはできなかった。 また、16S遺伝子とrpoB遺伝子の解析と配列比較を行い、C. xerosisをCorynebacteriumと遺伝的に類似した他の種と鑑別することができた．

上記のように、本研究は、16S-23S rRNA遺伝子の遺伝子間スペーサー領域よりも高い多型性を示すことから、Corynebacterium属の系統解析に適した遺伝子として他の著者からも報告されているrpoB遺伝子の存在に基づいて行われた。 羊の皮膚膿瘍（カゼ性リンパ節炎）はC. pseudotuberculosisによって引き起こされ、その病原性の主要因はpld遺伝子によってコードされ、細菌の細胞膜に発現する外毒素phospholipase Dであることが知られている . この外毒素は、哺乳類細胞膜のスフィンゴミエリン中のエステル結合の加水分解を促進する透過因子であり、初期感染部位からリンパ系を経て局所神経節への二次感染部位への細菌の拡散に寄与すると考えられ、感染後のマクロファージの生存率低下にも関与していると考えられる . また、この外毒素は真皮壊死性病変を引き起こす。 しかし、この外毒素は、C. xerosisにおいて、膿瘍の発生に寄与する病原性毒素として報告されたことはない。

疫学的な論点としては、検体を採取したヒツジの生産システムが、C. xerosisが一般的な病原菌として報告されているブタに以前から使用されていたことなどが挙げられる。 また、羊の飼料には豚の副産物（豚糞堆肥）が含まれており、この副産物にはコリネバクテリウム属菌が含まれている可能性がある。 さらに、施設内には金属棒、釘、ワイヤーなどの尖ったものが多く、動物を傷つける可能性が高く、C. xerosisなどの菌の侵入経路になりうる可能性がある。 これらの要因から、施設内にC. xerosisが存在する可能性がある。 それ以上の調査は行われなかったが、飼い主への勧告は、すべての動物の膿瘍を取り除き、消毒すること、（病原体の拡散を避けるために）感染防止区域で、ペンの清掃を強化すること、柵、餌箱、床からすべての鋭角や物を除去することだった。 C. xerosisはC. pseudotuberculosisと同様に人獣共通感染症の可能性がある微生物であるため、人および動物への感染と他の農場への拡散を防ぐために、農場の動物および廃棄物の取り扱いには細心の注意を払うよう農家に勧告されました

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