APL har erbjudit tjänster för nativ gelanalys sedan 1998. I dag ignorerar tyvärr många laboratorier detta värdefulla verktyg eftersom de tror att nativa geler bara är för svåra att använda, eller för att de felaktigt tror att de bara kan användas med sura proteiner. På Alliance Protein Laboratories kör vi rutinmässigt nativa geler på både basiska och sura proteiner. Vi kör gärna prover åt dig och/eller samarbetar med dig för att utveckla ett protokoll för användning i ditt labb.
Vad är en nativ gel?
”Nativ” eller ”icke denaturerande” gelelektrofores körs i frånvaro av SDS. Medan den elektroforetiska rörligheten för proteiner vid SDS-PAGE främst beror på deras molekylmassa, beror rörligheten vid native PAGE på både proteinets laddning och dess hydrodynamiska storlek.
Den elektriska laddning som driver elektroforesen styrs av proteinets inneboende laddning vid pH-värdet i körbufferten. Denna laddning beror naturligtvis på proteinets aminosyrasammansättning samt på posttranslationella modifieringar, t.ex. tillsats av sialinsyror.
Då proteinet behåller sin veckade konformation kommer dess hydrodynamiska storlek och rörlighet på gelen också att variera med karaktären på denna konformation (högre rörlighet för mer kompakta konformationer, lägre för större strukturer som oligomerer). Om native PAGE utförs nära neutralt pH för att undvika sur eller alkalisk denaturering kan den användas för att studera konformation, självassociation eller aggregering och bindning av andra proteiner eller föreningar.
Därmed kan nativa geler vara känsliga för varje process som förändrar antingen laddningen eller konformationen hos ett protein. Detta gör dem till utmärkta verktyg för att upptäcka saker som:
-
förändringar i laddning på grund av kemisk nedbrytning (t.ex. deamidering)
-
Oppveckad, ”smält globul” eller andra modifierade konformationer
-
oligomerer och aggregat (både kovalenta och icke-kovalenta)
-
Bindningshändelser (protein-protein eller protein-ligand)
Dessa egenskaper, och deras relativt höga genomströmning gör nativa geler till utmärkta verktyg för att analysera prover med accelererad stabilitet, visa jämförbarhet mellan olika partier eller processer eller undersöka effekterna av hjälpämnen.
En annan fördel med nativa geler är att det är möjligt att återvinna proteiner i sitt nativa tillstånd efter separationen. Återvinning av aktiva biologiska material kan dock behöva göras före fixering eller färgning.
Notera att de nativa geler som diskuteras här nu ibland kallas ”clear native” geler. De skiljer sig i princip från så kallade ”blå nativa” geler, som är beroende av att bindning av färgämne ger proteinet en mycket hög elektrisk laddning, som överväldigar den inneboende laddningen i polypeptiden. Om mängden bundet färgämne antas vara proportionell mot proteinets massa kan den rörlighet som observeras med hjälp av detta ”blue native”-protokoll användas för att uppskatta den molära massan genom att jämföra med proteinstandarder, på samma sätt som man gör för SDS-PAGE. De massestandarder som säljs för användning med blå nativa geler kan inte användas för att uppskatta den molära massan för de äkta nativa geler som diskuteras här.