PMC

GENOME ANNOUNCEMENT

Escherichia coli BL21 i BL21(DE3), stworzone przez F. Williama Studiera i Barbarę A. Moffatt (1), są powszechnie stosowanymi szczepami laboratoryjnymi do produkcji białek rekombinowanych. Brak proteaz lon i ompT, często uważanych za wspólne cechy linii B, przyczynił się do rozwoju tych szczepów jako gospodarzy do ekspresji białek. E. coli BL21(DE3), pochodna BL21, jest prawdopodobnie najszerzej stosowana w wysokopoziomowej ekspresji białek rekombinowanych, a jej nośnikiem jest profag DE3 pochodzący z bakteriofaga λ, który przenosi gen polimerazy T7 RNA pod kontrolą promotora lacUV5. E. coli BL21 jest rutynowo używana do ekspresji nie-T7, a ostatnio została również zmodyfikowana do produkcji szczepionki z plazmidowym DNA, ze względu na jej lepszą wydajność w hodowlach wsadowych o wysokiej gęstości komórek w porównaniu do szczepów K-12 (2).

Sekwencja genomu E. coli BL21(DE3) została wcześniej określona przez nasz instytut (3). W zasadzie, sekwencja genomu BL21 byłaby identyczna z sekwencją BL21(DE3), z wyjątkiem profaga DE3. Jednakże, mogą wystąpić różnice między stadami, które mogą mieć poważne konsekwencje dla eksperymentów (4). Mając informacje o genomie E. coli BL21(DE3) jako odniesienie, skonstruowano pełną sekwencję genomu BL21 używając jedynie sekwencjonowania następnej generacji i zidentyfikowano różnice genomowe baza po bazie.

Szczep E. coli BL21 został zakupiony od TaKaRa Bio (numer kodu 9126, numer partii K142). Sekwencjonowanie genomu przeprowadzono w Human Derived Material Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), przy użyciu systemu Illumina HiSeq 2000. Kompletną sekwencję genomu BL21 uzyskano zarówno poprzez opracowane mapowanie referencyjne, jak i montaż de novo 101-nt odczytów Illumina (47 123 524 sparowanych odczytów z biblioteki ~150-bp) przy użyciu CLC Genomics Workbench w wersji 6.5.1 (CLC bio).

Oczekiwaliśmy, że zmodyfikowana sekwencja genomu BL21(DE3) (CP001509.3)- z której usunięto region profagów, pozostawiając jedną kopię miejsca przyłączenia lambda (attB)- będzie służyć jako najlepsza sekwencja referencyjna. Jednakże, analiza pokrycia z pierwszego mapowania wykazała, że attB BL21 nie było puste, ale zajęte przez 12,1-kb długości λ*B profaga, jak u E. coli REL606 (3), co było zgłaszane jako wspólna cecha wśród linii B (5). Druga próba mapowania referencyjnego, z użyciem zmodyfikowanej sekwencji posiadającej sekwencję profaga λ*B, ujawniła inny region o niskim pokryciu pomiędzy genem ybhC a lewą granicą miejsca przyłączenia lambda, attL. Poprzez porównanie sekwencji, najlepiej pasująca sekwencja została zidentyfikowana z kontigów zmontowanych de novo i była o 23 bp dłuższa niż odpowiadający jej region z BL21(DE3). Następnie przygotowano zaktualizowaną sekwencję referencyjną poprzez zastąpienie regionu o niskim pokryciu i jego sąsiada (~200 bp) i ponownie przeprowadzono mapowanie. Jednolite pokrycie odczytów na całej końcowej sekwencji referencyjnej zostało potwierdzone wizualnie, a żadna inna różnica nie została znaleziona przez jakościową detekcję SNV/zmian strukturalnych lub przez analizę punktów przerwania. Asocjacja z użyciem niezmapowanych odczytów nie doprowadziła do powstania kontigów, które mogłyby potwierdzić obecność regionów specyficznych dla BL21. Anotacja genomu została przeprowadzona przez usługę NCBI Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline (PGAAP).

.