The Giant Protein Titin

Standardowe żele białkowe o zawartości akrylamidu od 6% do 15% były powszechnie stosowane do wykrywania pasm białkowych w zakresie od 10- do 200-kD. Ponieważ metoda ta wyklucza wykrywanie większych białek, dopiero dwie dekady temu badacze odkryli nowe gigantyczne białko o wyjątkowo niskiej pozornej ruchliwości, stosując niekonwencjonalne 2% żele. Masa molekularna tego nowego białka, cytyny1 (zwanej również connectin2 ), została wcześniej oszacowana na zakres od 1,2 do 3,0 MD (przeglądy, patrz Referencje 3 i 4). Gdy intensywność pasm cytyny na żelach SDS porównuje się z intensywnością innych białek miofibrylarnych, okazuje się, że cytyna jest, po miozynie i aktynie, trzecim najobficiej występującym białkiem mięśniowym, stanowiąc ≈10% łącznej zawartości białek mięśniowych. Dorosły człowiek o masie ciała 80 kg może więc zawierać około pół kilograma cytyny. Biorąc pod uwagę jej obfitość, późne odkrycie cytyny jest dość zaskakujące.

W latach 80. badania mikroskopii elektronowej z użyciem przeciwciał specyficznych dla cytyny wykazały, że cytyna jest integralną częścią miofibryli. Wykazano, że pojedyncze cząsteczki cytyny rozciągają się od tarczy Z do linii M, tworząc w ten sposób trzeci system filamentów sarkomerycznych, oprócz filamentów grubych (głównie miozyny) i cienkich (głównie aktyny).5 Odpowiednio, oczyszczone natywne cząsteczki cytyny wizualizowane za pomocą mikroskopii elektronowej miały długość >1 μm.6 Co więcej, cząsteczki te wyglądały jak pręcik z paciorkowatą podstrukturą,6 ponieważ ich łańcuchy peptydowe składają się głównie z powtórzeń Ig-podobnych i FN3-podobnych,7 które składają się w domeny globularne i stanowią prawie 90% masy cytyny (ryc. 1). W paśmie A powtórzenia te układają się w wysoce uporządkowane wzory i pomagają w organizacji struktury grubego włókna, zapewniając regularnie rozmieszczone miejsca wiązania z innymi białkami pasma A, zwłaszcza z lekką meromiozyną i białkiem C (przegląd, patrz odnośnik 15). Ze względu na ścisłe połączenie z białkami grubowłóknistymi, część A pasma cytyny jest funkcjonalnie sztywna w warunkach fizjologicznych. Natomiast część pasma I cytyny jest elastyczna.517 Gdy filamenty cytyny są usuwane z sarkomeru lub degradowane przez promieniowanie lub proteazy, sztywność rozluźnionej miofibryli zmniejsza się (przegląd piśmiennictwa, patrz: Referencje 3 i 4). Ostatnio wykazano, że cytyna znosi większość napięcia spoczynkowego podczas fizjologicznego rozciągania, zarówno w mięśniach szkieletowych, jak i sercowych.1819

Podejście na poziomie molekularnym do zbadania roli cytyny w strukturze i elastyczności mięśni stało się łatwiejsze po określeniu sekwencji cDNA ludzkich cytyn szkieletowych i sercowych.8 Jak sugerowano wcześniej na podstawie różnej ruchliwości cytyny szkieletowej i sercowej w żelach SDS,2021 obecnie jasne jest, że cytyna ulega ekspresji w różnych izoformach w różnych tkankach mięśniowych.8 Na przykład, ludzka sercowa cytyna jest kodowana przez gigantyczny 82-kb mRNA, który zawiera 81-kb otwartą ramkę odczytu kodującą 27 000-rezydujący peptyd (Mr, 2993 kD). W przeciwieństwie do niej, ludzka tytyna soleus jest znacznie większym polipeptydem, o masie cząsteczkowej ≈3700 kD. Różnice te są wynikiem serii alternatywnych splicingów tytyny pasma I w różnych tkankach mięśniowych.8

Elastyczność tytyny

Gdy rozluźnione włókna mięśniowe prążkowane są rozciągane, powstaje siła wciągająca, którą określa się jako napięcie bierne lub spoczynkowe (sztywność). Od dawna wiadomo, że mięsień sercowy jest znacznie sztywniejszy niż mięsień szkieletowy. Wcześniej sądzono, że wysoka sztywność bierna tkanki mięśniowej serca wynika głównie z niskiej podatności struktur zewnątrzkomórkowych, takich jak kolagen,22 ale wraz z pojawieniem się preparatu pojedynczego miocytu,23 stało się jasne, że sztywne struktury muszą być zlokalizowane, przynajmniej częściowo, wewnątrz komórki.2425 Sztywne elementy zewnątrzkomórkowe, które pomagają zapobiegać nadmiernemu rozciąganiu tkanki mięśniowej, mogą występować tylko przy bardziej ekstremalnych obciążeniach. Ostatnio można było również wykazać, że znaczna siła bierna powstaje przy rozciąganiu rozluźnionych, pojedynczych, izolowanych miofibryli, przy czym preparaty sercowe są o rząd wielkości sztywniejsze niż preparaty szkieletowe.19 Obecnie wiadomo, że te różnice w sztywności wynikają ze specyficznej dla danego typu mięśnia ekspresji wariantów tytyny o różnej długości lub, bardziej precyzyjnie, z różnej ekspresji dwóch różnych rodzin motywów tytyny w paśmie I (ryc. 1).813 Jeden typ motywów jest reprezentowany przez tandemowo ułożone domeny Ig. Najsztywniejszy mięsień prążkowany kręgowców, serce, wykazuje ekspresję 40 domen tandemowych Ig, podczas gdy znacznie bardziej elastyczny mięsień prosty (soleus) wykazuje ekspresję 93 domen tandemowych Ig. Innym różnie wyrażanym segmentem tytyny pasma I jest odrębny typ motywu określany jako domena PEVK, ponieważ reszty prolinowe, glutaminianowe, walinowe i lizynowe stanowią ≈70% jego sekwencji.8 Ta domena PEVK jest również najkrótsza w sercu i znacznie dłuższa w mięśniach szkieletowych: region PEVK ludzkiego serca obejmuje 163 reszty, podczas gdy region PEVK ludzkiego mięśnia podeszwowego ma ≈2200 reszt (ryc. 1).8

Odkrycie zróżnicowanej ekspresji zarówno regionu PEVK, jak i tandemowego regionu Ig w cytynie spowodowało konieczność zidentyfikowania względnego udziału tych dwóch odrębnych segmentów pasma I w elastyczności miofibryli. Taka identyfikacja została ostatnio podjęta przez monitorowanie pozycji wybranych epitopów przeciwciał przeciwko pasmu I-tytyny w rozciągniętych pojedynczych miofibrylach13 lub włóknach mięśniowych,14 oprócz pomiaru pasywnej odpowiedzi na rozciąganie próbek (ryc. 2; porównaj z odniesieniem 13 ). Zasugerowano, że przy luźnej długości sarkomerów domeny I-band tityny znajdują się w stanie zwartym, podczas gdy niewielkie rozciąganie może indukować prostowanie regionów tandem-Ig.13142728 To początkowe wydłużenie jest skorelowane z niewielkim (mięsień sercowy) lub nawet pomijalnym (mięsień szkieletowy) wzrostem pasywnego napięcia tylko202125 i dlatego może nie być spowodowane przez rozwijanie modułów tandem-Ig, które, jak wykazano, niezależnie składają się w termodynamicznie stabilne domeny.9 Przy umiarkowanych i długich odcinkach, główne wydłużenie wydaje się zachodzić w regionie PEVK, przynajmniej w miofibrylach szkieletowych,1314 podczas gdy bierne napięcie stale wzrasta (ryc. 2). W miofibrylach mięśnia sercowego krótki region PEVK8 może również podtrzymywać bierne napięcie, ale tylko w ograniczonym stopniu (porównaj z legendą do Ryc. 2). Po wyczerpaniu rozciągliwości segmentu PEVK, bierne napięcie może być określane głównie przez rozwijanie domen Ig2728 ; jednakże, ponieważ maksymalna długość mięsni sercowych nie przekracza ≈2,4 μm in vivo, takie rozwijanie jest mało prawdopodobne w warunkach fizjologicznych.13

Podsumowując, wysoka rozciągliwość regionu PEVK podczas fizjologicznych ilości rozciągania1314 sugeruje, że domena ta jest zdolna do rozwinięcia się do wydłużonego łańcucha polipeptydowego. Dlatego też, region PEVK cytyny i tandemowe domeny Ig mogą stanowić system dwóch sprężyn działających szeregowo. Specyficzna dla danej tkanki ekspresja obu sprężyn w różnych wariantach długościowych może teraz wyjaśnić, dlaczego bierne właściwości mechaniczne mięśni prążkowanych są tak zróżnicowane. Ekspresja różnych długości segmentów tandem-Ig w różnych typach mięśni może być istotna dla ustalenia fizjologicznej długości luźnych sarkomerów, podczas gdy zróżnicowany splicing sekwencji bogatych w PEVK może kontrolować charakterystyczną sztywność rozluźnionej tkanki mięśniowej. Obecnie ważnym zadaniem jest odkrycie, która struktura trzeciorzędowa umożliwia regionowi PEVK cytyny uleganie masywnym i szybko odwracalnym zmianom konformacyjnym, które zasadniczo decydują o biernym napięciu i elastyczności miofibryli.

Emerging Roles of Titin in Muscle Cell Biology

Obecnie nie wiadomo, które komórkowe mechanizmy transdukcji sygnału mogą kontrolować translację, montaż, a także demontaż i obrót olbrzymiego polipeptydu cytyny podczas miogenezy i wzrostu. Tytyna zawiera setki miejsc wiążących dla miozyny, białka C i białek linii M715 i prawdopodobnie dla znacznej liczby niezidentyfikowanych jeszcze białek Z-dysku i I-bandu. Jak zatem komórka mięśniowa kontroluje translację 27 000- do 33 000-rezidowego peptydu cytyny i jak synteza cytyny może być ściśle sprzężona ze składaniem ligandów cytyny podczas miogenezy? Atrakcyjnym modelem byłoby to, że mRNA tytyny, miozyny i białka C są kolokalizowane i kotranslacyjnie montowane,29 zmuszając w ten sposób powstające łańcuchy peptydowe do tworzenia siatki białek w porządku parakrystalicznym stwierdzonym in vivo. Wyraźnie widać, że lepsze zrozumienie, w jaki sposób supramolekularny zespół cytyny / grubych włókien jest w stanie utworzyć wysoce uporządkowaną trójwymiarową siatkę, musi teraz pochodzić z biochemicznej charakterystyki wyrażonych fragmentów cytyny, miozyny i białka C, a być może z badań metabolizmu mRNA cytyny.

Jeden z unikalnych wtrętów sekwencyjnych cytyny, zlokalizowany blisko C-końca, koduje domenę kinazy serynowo-treoninowej (ryc. 1).7 Domena ta i organizacja flankujących ją powtórzeń Ig i FN3 są bardzo podobne do tych, które występują w białkach olbrzymich bezkręgowców, twitchinie i projektinie.3334 W domenach kinazowych zarówno twitchin jak i titin wykazano miejsca wiązania kalmoduliny.3536 Ostatnio wykazano, że kinaza twitchin z mięczaka Aplysia jest aktywowana o kilka rzędów wielkości przez wszechobecny, regulowany wapniem kofaktor S100.37 Dlatego wydaje się prawdopodobne, że włókna twitchin – a być może także titin – reprezentują nowy, wrażliwy na wapń system filamentów w mięśniach. Pomimo coraz lepszego poznania czynników, które kontrolują aktywność kinaz tytyny i twitchiny na sztucznych substratach, prawdziwy substrat tych kinaz (a tym samym ich rola fizjologiczna) pozostaje nieznany.

Aby lepiej zrozumieć fizjologię montażu/dezintegracji tytyny na poziomie molekularnym, ważnym krokiem może być odkrycie specyficznych miejsc wiązania na tytynie dla proteazy kalpainy, p94,16 (porównaj z ryc. 1). W przeciwieństwie do wszechobecnych kalpain ulegających ekspresji we wszystkich typach komórek, p94 ulega ekspresji tylko w tkankach mięśniowych. Używając p94 jako przynęty w drożdżowym badaniu hybrydowym, zidentyfikowano dwa odrębne miejsca wiążące p94 na filamencie cytyny.16 Pierwsze miejsce znajduje się w centralnym regionie pasma I cytyny. Możliwe, że rozszczepienie cytyny w tym miejscu przez p94 lub proteazy regulowane przez p94 może wyjaśniać, dlaczego cytyna łatwo ulega degradacji do tak zwanej cytyny T2 (lub beta-koneksantyny).3 Następnie, T2 może być fizjologicznym produktem rozpadu cytyny zaangażowanym w obrót miofibryli. Ponadto, drugie miejsce wiążące cytynę z p94 znajduje się na C-końcowym końcu filamentu, co pokrywa się z ostatnią unikalną sekwencją wstawki cytyny (ryc. 1). Chociaż nie jest jasne, dlaczego w cytynie obecne są co najmniej dwa odrębne miejsca wiążące p94, istnieje możliwość, że – ponieważ rozpuszczalna p94 ulega bardzo szybkiej degradacji i jej okres półtrwania wynosi 30 minut – miejsca wiążące p94 w cytynie mogą funkcjonować w celu sekwestracji proteazy kalpainy do ustabilizowanego stanu kompleksu. Co ciekawe, C-końcowy motyw wiążący p94 z cytyną jest pomijany w niektórych tkankach mięśniowych w wyniku splicingu różnicowego,38 co dodaje kolejny poziom złożoności do interakcji między p94 a cytyną i podnosi możliwość tkankowo-specyficznej kontroli stabilności cytyny.

Aspekty patofizjologiczne

Wreszcie, molekularne zrozumienie interakcji między filamentem tytyny a p94 lub innymi proteazami kalpainy może wynagrodzić nam dokładniejsze zrozumienie degeneracji i regeneracji mięśni, ze szczególnym uwzględnieniem sytuacji patofizjologicznej. Dokładne badanie białek obecnych w biopsjach mięśni od pacjentów zdrowych i z dystrofią wykazało degradację tytyny w DMD i FCMD.39 Ostatnio stwierdzono, że mutacje w specyficznej dla mięśni proteazie kalpainowej p94 powodują LGMD-2A.40 Ponieważ cytyna zapewnia specyficzne miejsca wiązania dla p94,16 pojawia się intrygująca możliwość, że genetycznie odrębne dystrofie mięśniowe, takie jak FCMD, DMD i LGMD-2A, mają wspólną dysregulację interakcji p94-tytyna, co następnie prowadzi do patologicznej kruchości systemu filamentów cytyny jako wspólnego, wtórnego mechanizmu chorobowego.

Podsumowując, filamenty cytyny odgrywają ważną rolę zarówno w fizjologicznym, jak i patofizjologicznym funkcjonowaniu mięśni. Podczas gdy regularna struktura tytyny w paśmie A wydaje się być krytyczna dla uporządkowanego zespołu sarkomerów, jasne jest, że elastyczność tytyny w paśmie I określa pasywne właściwości mechaniczne miofibryli. W przyszłości, lepsze molekularne zrozumienie elastycznych wła¶ciwo¶ci tytyny w pa¶mie I może zostać uzyskane dzięki kombinowanemu podej¶ciu, wykorzystuj±cemu zarówno biofizyczne, jak i molekularne techniki biologiczne. Jeśli chodzi o potencjalną aktywność kinazową cytyny i jej przewidywaną rolę w transdukcji sygnału, wciąż czekamy na bardziej szczegółowe badania. Wreszcie, aby jeszcze bardziej odkryć udział cytyny w procesach patofizjologicznych, konieczne będzie zbadanie modułów ekspresji cytyny pod kątem możliwych interakcji z innymi białkami miofibrylarnymi i cytozolowymi, a tym samym funkcjonalne scharakteryzowanie tych interakcji na poziomie molekularnym.

Wybrane skróty i akronimy

Footnotes

.