KOMMENTAR
Färgämnesexkludering är en enkel och snabb teknik för att mäta cellens livsduglighet, men den är behäftad med problemet att livsdugligheten bestäms indirekt utifrån cellmembranets integritet. Det är alltså möjligt att en cells livskraft kan ha äventyrats (mätt som kapacitet att växa eller fungera) trots att dess membranintegritet (åtminstone övergående) bibehålls. Omvänt kan cellens membranintegritet vara onormal, men cellen kan ändå reparera sig själv och bli fullt livskraftig. Ett annat potentiellt problem är att eftersom färgämnesupptaget bedöms subjektivt kan små mängder färgämnesupptag som tyder på cellskada gå obemärkt förbi. I detta avseende resulterar färgämnesexkludering som utförs med ett fluorescerande färgämne med hjälp av ett fluorescensmikroskop rutinmässigt i att fler icke livskraftiga celler med färgämnesupptag poängsätts än tester som utförs med trypanblått med hjälp av ett transmissionsmikroskop.
En mer sofistikerad metod för att mäta cellernas livsduglighet är att bestämma färgämnesexkludering med hjälp av flödescytometri. Detta kan göras med hjälp av trypanblått eftersom detta protein binder till proteiner och sedan avger en fluorescenssignal som kan detekteras i en flödescytometer (vid 660 nm när det är bundet till bovint serumalbumin) (se referens 2 för detaljer om användningen av trypanblått i flödescytometri). Alternativt kan uteslutning mätas med andra ljusemitterande färgämnen, t.ex. propidiumjodid (se enhet 5.4 för en beskrivning av användningen av propridiumjodid för utvärdering av cellviabilitet genom flödescytometrisk analys). Detaljerade jämförelser av uppskattningar av levande respektive döda celler med hjälp av trypanblåsexkludering utvärderad manuellt enligt beskrivningen här och utvärderad elektroniskt med flödescytometri visar att de två teknikerna ger mycket likartade resultat i erfarna händer. Medan det är mer sannolikt att den beskrivna tekniken med uteslutning av färgämne leder till fel på grund av operatörens subjektivitet, är flödescytometrin mindre lämplig för utvärdering av cellens livskraft under utförandet av komplexa och tidskrävande cellreningstekniker. Därför är en flödescytometrisk teknik endast tillämplig när exakta mätningar av antalet döda celler i en cellblandning måste erhållas.
Nyligen har det rapporterats om ett ”automatiserat fluorescensmikroskoplivslighetstest” där celllivsligheten med hjälp av propidiumjodid i samband med en anordning som räknar levande och döda celler i en bärbar cellräknare i mikroskop utrustad med ett mikrochip. Denna räknare sägs kunna bedöma cellernas livskraft snabbare än vare sig den manuella teknik som beskrivs här eller flödescytometern och ge mer exakta och tillförlitliga räkningar. Denna anordning kan vara användbar i situationer där många snabbt förvärvade analyser av cellviabiliteten krävs (3).
Det bör noteras att cellviabiliteten också kan bedömas med färgämnen som binder till DNA (etidiummonoazid), medel som binder till fosfatidylserin (Annexin V) och aminreaktiva färgämnen. Användningen av dessa alternativa medel kräver vanligtvis flödescytometri och kan därför endast tillämpas under särskilda förhållanden.
Trypanblåsexkludering, som beskrivs i ovanstående protokoll, kan utföras på 5 till 10 minuter.