PMC

Fallbeskrivning

Denna fallrapport härrör från ett rutinmässigt veterinärbesök på en gård med 155 djur, med två fårraser (Pelifolk och Blackbelly), belägen i Tesistán, kommunen Zapopan, delstaten Jalisco, Mexiko. Anläggningen har anpassats från en tidigare svinuppfödning och är fortfarande omgiven av svin- och boskapsuppfödningar i närområdet. Flocken hölls på upphöjda golv för att underlätta rengöring och hantering, men det fanns många rostade vassa föremål (t.ex. ståltråd, trasiga stängsel, spikar osv.) i boxarna och rengöringen utfördes inte ordentligt på gården vid inspektionstillfället. Utfodringen baserades på lokalt tillgängliga fodermedel, t.ex. grovfoder av låg kvalitet, gödselsilage från svin och kommersiellt kraftfoder med högt proteininnehåll. Denna gård ringde till veterinären på grund av frekventa hudabscesser hos djuren, men inga andra besvär relaterade till hudproblem rapporterades. Abscesser verkar inte påverka djurens produktivitet, men närvaron av sådana skador påverkar djurens marknadsföring negativt, och därför var ägaren intresserad av att ta reda på det etiologiska agenset och den rekommenderade behandlingen för att eliminera sjukdomen från gården. En certifierad veterinär tog prover av innehållet i abscesserna från 31 djur (29 tackor, 1 bagge och 1 lamm) och skickade dem till laboratoriet för bakteriologisk diagnos för att hitta de etiologiska agens som orsakade problemet. På grundval av utseendet på abscesserna var den presumtiva infektionsdiagnosen på gården för de flesta djuren kaseös lymfadenit. Den bakteriologiska analysen visade dock att 13 djur var infekterade med C. pseudotuberculosis, 1 med Corynebacterium spp., 2 med Proteus spp., 2 med Streptococcus spp. och i de återstående 13 fallen kunde patogenen inte identifieras. Kategoriseringen för isolatet av Corynebacterium spp. var oklar eftersom resultaten av de bakteriologiska och biokemiska testerna inte var slutledande.

Denna artikel beskriver isoleringen av C. xerosis från ett 4 månader gammalt Pelifolk-lam (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) i god kroppskondition. Såvitt vi vet är detta den första rapporten om C. xerosis som producerar en klinisk kutan abscess hos får. Djurägaren gav sitt informerade samtycke till att resultaten av den kliniska studien, inklusive fotomaterial, offentliggjordes. Djuret uppvisade en abscess med hård konsistens, utan dränering, på vänster sida av halsen (fig. 1a). Den första kliniska diagnosen tydde på fallande lymfadenit, eventuellt orsakad av C. pseudotuberculosis. Ett prov för bakteriologisk analys togs genom att punktera abscessen med en steril 5 ml spruta med en 20 gauge injektionsnål efter rengöring och desinficering av abscessens yta. Den typ av exsudat som uppsamlades var serösliknande och vitt till utseendet. Det biologiska provet förvarades vid 4 °C fram till den biologiska karakteriseringen vid Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 Toluca-Atlacomulco road, Toluca, Mexico, z.c. 50200). Tiden mellan provtagning och bearbetning var inte längre än 72 timmar. Provet odlades i två exemplar i 8 % fårblodagar och inkuberades 24-48 timmar vid 37 °C under aeroba och mikroaerofila förhållanden. Kolonier med en diameter på 1,0 mm, icke hemolytiska, gulbruna i färgen och något torra i utseendet observerades (fig. 2a). Dessa morfologiska egenskaper motsvarade inte dem som tidigare beskrivits för C. pseudotuberculosis, utan de verkade snarare vara kolonier från C. xerosis . Mikroskopiskt (10× förstoring; fig. 2c) observerades bakterierna som klubbliknande ändar, pleomorfa, oregelbundet färgade grampositiva stavar. Biokemiska tester gav följande resultat: Triple sugar Iron (TSI,-), Lysine Iron agar (LIA,-), Citrate test (CIT,-), Sulphide Indole-Motility (SIM,-), Motility, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxidative-fermentative (OF,-) Methyl red (-), Peptonvatten (-), Voger Pascaguer (-), Urea (-), Nitratbuljong (+), Trehalos (+), Sacros (+), Maltos (+) och Glukosjäsning (positiv vid 37 °C och negativ vid 42 °C). Dessa resultat skulle kunna motsvara en C. pseudotuberculosis-profil, med undantag för ureatestet, som var negativt i stället för positivt, och därför bättre stämmer överens med en C. xerosis-profil . De diagnostiska resultaten var inte entydiga, och även om API-systemet inte är specifikt för att identifiera C. xerosis beslutade vi därför att undersöka isolatet med detta system för att se om detta isolat skulle kunna identifieras som en annan Corynebacterium-art. För att ta reda på om detta isolat tillhör andra arter som C. freneyi och C. amycolatum, som sällan kan hittas hos får, testade vi dessutom om kolonin kunde växa vid 20 °C och om den kunde fermentera glukos vid 42 °C. Isolatet växte bra vid 20 °C och fermenterade inte glukos vid 42 °C, båda egenskaper som förknippas med C. xerosis och C. hansenii , därför bestämde vi oss för att utföra en molekylär analys för att ta reda på om vi molekylärt kunde identifiera isolatet som C. xerosis. Vi analyserade tre loci för att öka vår diagnostiska noggrannhet. Vi testade en gen som normalt saknas i C. xerosis men som finns i C. pseudotuberculosis, pld-genen, där vi förväntade oss att inte hitta någon amplikon efter PCR-testet om isolatet var C. xerosis i motsats till C. pseudotuberculosis. Ett andra lokus är inriktat på amplifiering av den intergeniska spacerregionen för 16S-23S rRNA-generna (16S-23S) med hjälp av primers som är utformade för C. pseudotuberculosis och som har rapporterats inte fungera för C. xerosis , och vi skulle också förvänta oss att det inte finns något amplifikationsband för C. xerosis och att det finns ett band på 816 bp för C. pseudotuberculosis. Slutligen utförde vi PCR-amplifiering och sekvensering av rpoB-genen (446 bp), som tidigare har rapporterats skilja arter av Corynebacterium . DNA-extraktion utfördes med hjälp av ett kommersiellt kit (KAPA Express Extract) enligt tillverkarens protokoll. En multiplex-PCR-teknik för amplifiering av partiella sekvenser av pld-, 16S-23S- och rpoB-generna utfördes med hjälp av det protokoll som publicerades av Pacheco 2007 . Reaktionerna utfördes med hjälp av ett kommersiellt multiplex-PCR-kit (QIAGEN Multiplex PCR) enligt tillverkarens specifikationer. PCR-analysen omfattade följande prover: Det isolat som skulle karakteriseras, det förmodade C. xerosis-isolat och två C. pseudotuberculosis (ett lokalt isolat som tidigare karakteriserats som biovar ovis och en referensstam, ATCC 43924, biovar equi) som användes som kontroller. Som förväntat för den förmodade C. xerosis amplifierades ett enda PCR-amplikonband på 446 bp, som motsvarar rpoB-genfragmentet, och de intergeniska 16S-23S-gen- och pld-genfragmenten amplifierades inte. Som förväntat uppvisade båda C. pseudotuberculosis-stammarna tre band på 203, 446 och 816 bp, som motsvarar generna pld, rpoB respektive 16S (fig. 3). RpoB-genamplikonerna från alla tre proverna renades med hjälp av Promegas reningskit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) och skickades för automatisk sekvensering av Macrogen (Rockville, MD, USA). Flera sekvensanpassningar som erhållits från BLAST (NCBI) analyserades tillsammans med våra isolatsekvenser med hjälp av Clustal W-analys från Mega 6.0.6 (fig. 4). Den fylogenetiska analysen utfördes med hjälp av grannföreningsmetoden (MEGA-programvara 6.0.6). Bootstrap-värden erhölls genom att generera 1000 slumpmässiga träd. Den fylogenetiska analysen omfattade även sekvenserna från rpoB-genen från C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) och C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Det var möjligt att observera olika fylogenetiska grupper som motsvarade särskilda arter av Corynebacterium. Dessa resultat, bekräftar att denna studies isolat (rpoB C53) är C. xerosis (Fig. 4).

Genotypningstekniker som PCR samt sekvensanalys av rpoB C53-isolat i den här studien bidrog i hög grad till en korrekt artbestämning, som ursprungligen var missvisande när man använde fenotypiska mikroskopiska och biokemiska egenskaper. Corynebacterium xerosis har tidigare rapporterats i kliniska prover från mänskliga fall i lesioner vid endokardit, pneumonit, osteomyelit och hudinfektioner, särskilt hos immunsupprimerade patienter . Den har också påträffats i kliniska prover från djur, t.ex. i leverskador hos getter (misstänkt pseudotuberkulos) och i komjölk från djur med mastit. Hos svin har C. xerosis isolerats från lesioner i olika vävnader, t.ex. lever, njurar, lungor, mjälte, leder samt från subkutana abscesser. Dessutom har C. xerosis isolerats från kliniska prover från livmodern hos får i ett fall av abort och från lungvävnad hos djur med andningsproblem. Dessa isolat identifierades och karakteriserades genom amplifiering av rRNA 16S-23S-genen med hjälp av PCR-RFLP. I dessa studier var det dock inte möjligt att få fram ett bandmönster som var tillräckligt tydligt för att skilja C. xerosis från andra arter av Corynebacterium. Författarna genomförde också en analys och sekvensjämförelse av generna 16S och rpoB, vilket gjorde det möjligt för dem att skilja C. xerosis från andra arter som genetiskt liknar Corynebacterium .

Som nämnts ovan genomfördes denna studie baserat på förekomsten av genen rpoB, som har rapporterats av andra författare som den gen som är den bästa genen för fylogenetisk analys av släktet Corynebacterium, eftersom den uppvisar en hög polymorfism, till och med större än den intergeniska spacer-regionen av 16S-23S rRNA-generna . Det är känt att kutana abscesser hos får (kaseös lymfadenit) orsakas av C. pseudotuberculosis och att dess viktigaste virulens- och patogenicitetsfaktor är exotoxinet fosfolipas D, som kodas av pld-genen och uttrycks i bakteriens cellmembran . Detta exotoxin är en permeabilitetsfaktor som främjar hydrolys av esterbindningarna i sfingomyelin i däggdjurscellmembran, vilket möjligen bidrar till spridningen av bakterier från det första infektionsstället till sekundära ställen via lymfsystemet till regionala ganglier, och det tycks vara inblandat i minskningen av makrofagernas livsduglighet efter infektion . Exotoxinet orsakar också dermonekrotiska lesioner . Exotoxinet har dock inte rapporterats hos C. xerosis som ett patogent toxin som skulle kunna bidra till utvecklingen av abscesser. Detta understryker vikten av att bedriva ytterligare forskning om infektionsmekanismerna hos denna Corynebacterium-art.

En viktig diskussionspunkt av epidemiologisk karaktär är bland annat det faktum att det produktionssystem för får, där provet togs från, tidigare användes för svin, en art där C. xerosis har rapporterats som en vanlig patogen . Dessutom innehåller en av huvudingredienserna i fårfoderet biprodukter från svin (gödsel från svin), som eventuellt kan innehålla aktiva patogener, kanske även Corynebacterium spp. Dessutom är vassa föremål, t.ex. metallstänger, spikar och trådar, utspridda över hela anläggningen, vilket ökar risken för att djuren skadas, vilket kan ge Corynebacterium spp. en möjlighet att ta sig in i organismen, inklusive C. xerosis. Alla dessa faktorer kan ha bidragit till förekomsten av C. xerosis i anläggningen. Inga ytterligare undersökningar genomfördes, men ägaren rekommenderades att avlägsna och desinficera abscesser från alla djur i ett smittskyddat område (för att undvika spridning av patogenerna), förstärka rengöringen av boxarna och ta bort alla vassa kanter och föremål från stängsel, foderautomater och golv. Eftersom C. xerosis och C. pseudotuberculosis är potentiellt zoonotiska mikroorganismer, rekommenderades jordbrukaren att vidta extrema försiktighetsåtgärder vid hantering av djur och avfall som produceras på gården för att förhindra att människor och djur smittas och att mikroorganismen sprids till andra gårdar.