En metod för att förhindra PD består av fysikalisk-kemisk optimering av PCR-systemet, dvs. ändring av koncentrationerna av primers, magnesiumklorid, nukleotider, jonstyrka och reaktionstemperatur. Denna metod är något begränsad av de fysikalisk-kemiska egenskaperna som också bestämmer effektiviteten i amplifieringen av målsekvensen i PCR. Därför kan en minskning av PD-bildningen också leda till minskad PCR-effektivitet. För att övervinna denna begränsning finns andra metoder som endast syftar till att minska bildningen av PDs, inklusive primerdesign och användning av olika PCR-enzymsystem eller reagenser.
Mjukvara för primerdesignEdit
Mjukvara för primerdesign använder algoritmer som kontrollerar potentialen för bildning av DNA:s sekundärstrukturer och för glödgning av primers mot sig själv eller inom primerpar. Fysiska parametrar som mjukvaran tar hänsyn till är potentiell självkomplementaritet och GC-innehåll i primrarna, liknande smälttemperaturer för primrarna och avsaknad av sekundära strukturer, t.ex. stambågar, i DNA-målsekvensen.
Hot-start PCREdit
Eftersom primrarna är utformade så att de har låg komplementaritet till varandra kan de glödgning (steg I i figuren) endast ske vid låg temperatur, t.ex. rumstemperatur, t.ex. under beredningen av reaktionsblandningen. Även om DNA-polymeraser som används i PCR är mest aktiva runt 70 °C har de en viss polymeriseringsaktivitet även vid lägre temperaturer, vilket kan leda till DNA-syntes från primers efter annealing till varandra. Flera metoder har utvecklats för att förhindra att PDs bildas tills reaktionen når arbetstemperaturen (60-70 °C), och dessa inkluderar inledande hämning av DNA-polymeraset, eller fysisk separation av reaktionskomponenter reaktionen tills reaktionsblandningen når de högre temperaturerna. Dessa metoder kallas PCR med varmstart.
Vax: I denna metod separeras enzymet rumsligt från reaktionsblandningen genom vax som smälter när reaktionen når hög temperatur.
Långsam frisättning av magnesium: DNA-polymeras kräver magnesiumjoner för aktivitet, så magnesiumet separeras kemiskt från reaktionen genom att binda till en kemisk förening och frigörs i lösningen först vid hög temperatur
Non-kovalent bindning av hämmare: I denna metod binds en peptid, antikropp eller aptamer icke-kovalent till enzymet vid låg temperatur och hämmar dess aktivitet. Efter en inkubation på 1-5 minuter vid 95 °C frigörs inhibitorn och reaktionen startar.
Köldkänsligt Taq-polymeras: är ett modifierat DNA-polymeras med nästan ingen aktivitet vid låg temperatur.
Kemisk modifiering: i denna metod binds en liten molekyl kovalent till sidokedjan av en aminosyra i DNA-polymerasets aktiva plats. Den lilla molekylen frigörs från enzymet genom att reaktionsblandningen inkuberas i 10-15 minuter vid 95 °C. När den lilla molekylen frigörs aktiveras enzymet.
Strukturella modifieringar av primersEdit
En annan metod för att förhindra eller minska PD-bildningen är att modifiera primers så att annealing med dem själva eller med varandra inte orsakar förlängning.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): en nukleotidsvans, som är komplementär till primerns 3′-ändan, läggs till i primerns 5′-ändan. På grund av den nära närheten till 5′ svansen annealiseras den till primerns 3′ ände. Resultatet är en primer i form av en stambåge som utesluter annealing med kortare överlappningar, men som tillåter annealing av primern till dess fullständigt komplementära sekvens i målet.
Chimeriska primers: Vissa DNA-baser i primern ersätts med RNA-baser, vilket skapar en chimär sekvens. Smältningstemperaturen för en chimär sekvens med en annan chimär sekvens är lägre än för en chimär sekvens med DNA. Denna skillnad gör det möjligt att ställa in glödgningstemperaturen så att primern glödgas till sin målsekvens, men inte till andra chimära primers.
Blockade, avskiljbara primers: En metod som är känd som RNase H-beroende PCR (rhPCR) använder sig av ett termostabilt RNase HII för att avlägsna en blockerande grupp från PCR-primers vid hög temperatur. Detta RNas HII-enzym visar nästan ingen aktivitet vid låg temperatur, vilket gör att avlägsnandet av blockeringen endast sker vid hög temperatur. Enzymet har också en inneboende primer:template mismatch-diskriminering, vilket resulterar i ytterligare selektion mot primer-dimerer.
Förhindra signalförvärv från primer-dimererRedigera
Med tanke på att metoderna ovan är utformade för att minska PD-bildningen, syftar ett annat tillvägagångssätt till att minimera den signal som genereras från PD:er i kvantitativ PCR. Detta tillvägagångssätt är användbart så länge det bildas få PD:er och deras hämmande effekt på produktackumulationen är liten.
Fyrastegs-PCR: Används när man arbetar med ospecifika färgämnen, t.ex. SYBR Green I. Det bygger på PD:ernas och målsekvensens olika längd, och därmed olika smälttemperatur, och målsekvensen. I denna metod erhålls signalen under målsekvensens smälttemperatur, men över PDs smälttemperatur.
Sekvensspecifika prober: TaqMan- och molekylära fyrsonder genererar signal endast i närvaro av sin målsekvens (komplementär sekvens), och denna ökade specificitet utesluter signalförvärv (men inte eventuella hämmande effekter på produktackumulationen) från PD:er.