Ames test it is a biological assay to assess the mutagenic potential of chemical compounds. Utiliza bactérias para testar se uma determinada substância química pode causar mutações no DNA do organismo a ser testado. O teste foi desenvolvido por Bruce N. Ames nos anos 70 para determinar se um produto químico em questão é mutagênico.
Objetivo
Para determinar a atividade mutagênica de produtos químicos, observando se eles causam mutações nas bactérias da amostra.
Princípio
- Teste Ames usa várias cepas de bactérias (Salmonella, E.coli) que carregam uma determinada mutação.
- Mutações pontuais são feitas na histidina (Salmonella typhimurium) ou no óperon triptofano (Escherichia coli), tornando a bactéria incapaz de produzir o aminoácido correspondente.
- Estas mutações resultam em seus organismos que não podem crescer a menos que a histidina ou triptofano seja fornecido.
- Mas o cultivo da His- Salmonella está em um meio contendo certos químicos, causa mutação no gene codificador da histidina, de modo que eles recuperam a capacidade de sintetizar a histidina (His+). Isto quer dizer que quando um evento mutagênico ocorre, substituições de base ou mudanças de quadros dentro do gene podem causar uma reversão para a prototrofia de aminoácidos. Esta é a mutação reversa.
- Estas bactérias revertidas irão então crescer em meios deficientes em histidina ou triptofano, respectivamente.
O potencial mutagênico de uma amostra é avaliado expondo organismos que necessitam de aminoácidos a concentrações variáveis de químicos e selecionando para o evento de reversão. Meios sem o aminoácido específico são usados para esta seleção que permitem que apenas as células que sofreram a reversão para a histidina / triptofano prototrofia sobrevivam e cresçam. Se a amostra de teste causar esta reversão, é um mutagênio.
Método
I ) Isolar uma cepa auxotrofica de Salmonella Typhimurium para histidina. (ie. His-ve)
II) Prepare uma suspensão de teste de suave Salmonella Typhimurium em um tampão simples com o produto químico de teste (ex. 2-aminofluoreno). Adicione também uma pequena quantidade de histidina.
Nota: uma pequena quantidade de histidina é necessária para que as bactérias comecem a crescer. Uma vez que a histidina está esgotada, apenas as bactérias mutantes ganham a capacidade de sintetizar a histidina formando colônias.
III) Prepare também uma suspensão de controle de His-ve Salmonella Typhimurium mas sem os químicos de teste.
IV) Incubar as suspensões a 37°C durante 20 minutos
V) Preparar as duas placas de ágar e espalhar a suspensão sobre a placa de ágar.
VI) Incubar as placas a 37°C durante 48 horas.
VII) Após 48 horas contar o número de colónias em cada placa.
Resultado Interpretação
- A mutagenicidade dos químicos é proporcional ao número de colónias observadas.
- Se houver um grande número de colónias na placa de teste em comparação com o controlo, então diz-se que tais químicos são mutagénicos.
- Muitos poucos números de colónias também podem ser vistos na placa de controlo. Isto pode ser devido à mutação espontânea pontual no gene codificador de hisidina.
Usos
Embora o teste Ames seja usado para identificar as mutações de reversão que estão presentes nas cepas, ele também pode ser usado para detectar a mutagenicidade de amostras ambientais como drogas, corantes, reagentes, cosméticos, águas residuais, pesticidas e outras substâncias que são facilmente solubilizadas em uma suspensão líquida.
Merits
- Ensaio bacteriano simples, rápido e robusto.
- O teste é fácil e de baixo custo, tornando-o inestimável para a triagem de substâncias em nosso ambiente para possível carcinogenicidade.
- O teste pode detectar mutantes adequados em grande população de bactérias com alta sensibilidade.
Limitações
- Algumas substâncias que causam câncer em animais de laboratório (dioxina, por exemplo) não dão um teste Ames positivo (e vice-versa)
- O ensaio de Salmonella typhimurium consiste em cepas de Salmonella typhimurium e por isso não é um modelo perfeito para humanos.