Expressão e purificação de GyrB e GyrA
A sequência de codificação do E. coli GyrA completo (2-875) foi inserida em um pET28b modificado contendo um N-terminal 10-His tag e um C-terminal Twin-strep tag. A superexpressão foi realizada em E. coli BL21 (DE3) pRARE2 em meio LB contendo 50 µg/mL de canamicina e 35 µg/mL de cloranfenicol. As células foram induzidas com IPTG 0,35 mM após alcançar uma OD600 0,85 e a proteína foi expressa a 37 °C durante 4 h. As células foram colhidas e ressuspendidas em tampão de lise (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% v/v glicerol, pH 8,0) e lisadas com três ciclos de ruptura de alta pressão usando EmulsiFlex-C3 a 1500 bar. A proteína GyrA foi purificada por cromatografia de níquel-afinidade em uma coluna XK 26/20 embalada manualmente (Pharmacia) com resina quelante Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) ligada a íons Ni2+. A eluição foi realizada com o tampão de lise contendo 250 mM de imidazol pH 8,0 e as proteínas eluídas foram fixadas diretamente em uma Sepharose de Streptavidin de 10 ml (GE Healthcare). As proteínas foram amplamente lavadas com tampão Strep (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8,0) e eluída com tampão Strep contendo 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Tanto o tag 10-His tag como o Twin-strep tag foram subsequentemente clivados pela clivagem Pré-Cisão protease (P3C) e Tobacco Etch Virus (TEV) (relação de massa 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) de um dia para o outro a 4 °C. O GyrA foi então purificado por uma etapa de cromatografia de troca de ânions utilizando uma coluna HiTrap Q HP (GE Healthcare). A proteína foi eluida com um gradiente linear de 20 volumes de coluna com tampão B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol, pH 8,0). Frações contendo GyrA foram agrupadas e carregadas em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) usando Hepes 20 mM, NaGlu 50 mM, KAc 50 mM, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM, glicerol 10% v/v, pH 8,0. Foram obtidos 37 mg de GyrA a partir de 3 L de culturas. A sequência de codificação do GyrB (2-804) foi inserida na mesma pET28b modificada. A superexpressão foi realizada em E. coli BL21 (DE3) pRARE2 em meio LB contendo 50 µg/mL de canamicina e 35 µg/mL de cloranfenicol. As células foram induzidas com 0,35 mM IPTG após alcançar uma OD600 0,85 e a proteína foi expressa a 18 °C durante 18 h. O procedimento de purificação do GyrB é como descrito acima para o GyrA. 10 mg de GyrB foram obtidos a partir de 3 L de culturas.
Reconstituição completa de DNA gyrase
E. coli GyrA e GyrB foram misturados na razão equimolar para permitir a reconstituição completa de DNA gyrase. O complexo foi purificado em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) usando tampão crio-EM (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0.5 mM TCEP, pH 8.0) (Fig. 1 e Suplemento Fig. 1).
Preparação de ácido nucleico
Uma dupla dupla dupla seleção de 180 bp DNA duplex foi reconstituída usando 2 oligonucleotídeos sintéticos assimétricos fosforilados12 obtidos da Sigma-Aldrich (Tabela Suplementar 1). Em resumo, os ácidos nucléicos foram dissolvidos em água livre de DNAse a 1 mM de concentração. Para montar o DNA de cadeia dupla, cada oligonucleotídeo foi misturado a 1:1 molar, recozido por incubação a 95 °C durante 2 min e depois diminuída a temperatura em 1 °C a cada 1 min até atingir 20 °C. O duplex de DNA recozido duplamente recozido foi então trocado em tampão em Hepes 20 mM pH 8.0 com uma coluna BioSpin 6 (BioRad).
Formação complxa para cryo-EM
A gyrase de DNA purificada foi misturada com o 180 bp dsDNA a 1:1 razão molar com uma proteína final e concentração de DNA de 32 µM. A mistura foi incubada durante 10 min a 37 °C. Gepotidacina (GSK2140944, adquirido na MedChemExpress) ressuspenso a 10 mM em 100% DMSO foi adicionado para alcançar uma concentração final de 170 µM (1,7% DMSO). A mistura foi incubada durante 10 min a 37 °C. AMP-PNP (Sigma) foi adicionado ao complexo a uma concentração final de 340 µM. O complexo totalmente reconstituído foi ainda incubado durante 30 min a 30 °C. Finalmente, 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) foi adicionado ao complexo. A amostra foi centrifugada 2 h a 16.000 × g para remover potenciais agregados.
Preparação da grade crio-EM
Quantifoil R-1.2/1.3 Grades de cobre de 300 mesh foram carregadas por 20 s antes da aplicação de 4 µl do complexo. Após 30 s de incubação, as grelhas foram congeladas em etano líquido, utilizando uma marca Vitrobot IV (FEI) com 95% de umidade em câmara a 10 °C.
Microscopia eletrônica
Imagnóstico crio-EM foi realizado em um microscópio Titan Krios operado a 300 kV (FEI) equipado com uma câmera eletrônica direta K2 Summit (Gatan), um filtro de energia GIF Quantum (Gatan) operado em modo de energia zero com largura de fenda de 20 e-V, uma placa de fase Volta (FEI) e um corretor de CS (FEI). As imagens foram gravadas em modo de nanopropia EFTEM com Serial EM53 em modo de contagem de super-resolução com ampliação nominal de 130.000x com um pixel de super-resolução de 0,44 Å e um alvo de desfocagem constante de -500 nm (Suplemento Fig. 2c). O VPP foi avançado para uma nova posição a cada 100 min (Suplemento Fig. 2b). Quatro conjuntos de dados foram coletados com uma taxa de dose de 6 a 8 e-/pixel/s (0,88 Å pixel size at the specimen) no detector. As imagens foram registradas com uma dose total de 50 e-/Å2, tempo de exposição entre 7 a 10 s e subquadros de 0,2 a 0,25 s (35 a 50 quadros totais). Um total de 11.833 filmes foi registrado após a coleta de dados dos 4 conjuntos de dados.
Processamento de dados
Processamento de dados de cada conjunto de dados foi feito separadamente seguindo o mesmo procedimento até os refinamentos 3D, quando as partículas foram fundidas. Os subquadros com super-resolução dose-fracionamento foram corrigidos por ganho com IMOD54 e colocados no lixo duas vezes por Fourier, corrigidos por drift e dose-ponderados usando MotionCor255, produzindo imagens somadas com tamanho de 0,88 Å pixel. A função de transferência de contraste dos micrografos corrigidos foi estimada usando GCTF v1.0656. Anéis de Thon foram inspecionados manualmente para astigmatismo e micrografos com resoluções medidas piores que 4 Å foram descartados, produzindo 8.701 micrografos restantes. As partículas foram coletadas automaticamente pelo protocolo de coleta de blob Gaussian livre de referência em RELION229,30. Tomando em conjunto os 4 conjuntos de dados, um total de 1.572.962 partículas foram selecionadas. Quatro vezes as partículas de cada conjunto de dados foram submetidas separadamente a duas rodadas de classificação 2D em RELION2 para remover partículas de lixo e contaminações resultando em um total de 479.667 partículas para processamento posterior. As partículas dos quatro conjuntos de dados foram fundidas em um único conjunto de dados, seguido por uma re-extração com centralização em formato de 3 × 3 posições. Uma última rodada de classificação 2D foi então realizada, resultando numa pilha final de 338.616 partículas. A pilha de partículas subsequente foi sujeita a uma ronda de classificação 3D ab-initio em cryoSPARC31. Após descartar os modelos de má qualidade, o modelo ab-initio restante resultou em um conjunto de dados final de 191.456 partículas, com um limiar de probabilidade de classe de 0,9 (Fig. 2a suplementar). O modelo ab-initio foi filtrado a 30 Å e utilizado como referência para refinamento homogêneo em crio-SPARC, resultando em um mapa de 5,4 Å. As coordenadas das partículas refinadas foram então utilizadas para a estimativa local de CTF usando GCTF v1,06 seguido por re-extração de 2 × 2 partículas encartadas com centralização. Esta nova pilha de partículas foi submetida a um auto-refinamento 3D em RELION2 utilizando o modelo ab-initio de baixa passagem filtrada a 30 Å, resultando num mapa com resolução global de 5,0 Å (Fig. 3 Complementar). A resolução local mostrou um intervalo de resolução de 4,0 Å no núcleo de ligação/leavagem do DNA até 9,0 Å no domínio ATPase e o GyrA β-pinwheel que envolve o DNA, indicativo de alta flexibilidade destes dois módulos. Para obter uma reconstrução final do complexo completo com densidades bem definidas para cada domínio, realizamos a classificação 3D sem alinhamento, produzindo várias classes diferentes. As partículas de três classes foram fundidas (94.633 partículas). A pilha subsequente de partículas de 1 × 1-binned foi refinada em RELION2 sem máscara até as iterações tardias de refinamento onde uma máscara macia foi aplicada para melhorar a resolução. O pós-processamento do mapa produziu uma reconstrução de 6,6 Å de resolução do complexo geral (Suplemento 3).
Uma combinação de diferentes abordagens locais foi utilizada para identificar diferentes conformações e para melhorar a resolução local de cada domínio. Como o domínio ATPase era muito pequeno para um refinamento focado em 3D, primeiro realizamos uma classificação 3D focada do domínio ATPase com uma máscara macia e sem alinhamento em RELION2. Foi selecionada uma classe de 58.329 partículas com uma densidade bem definida do domínio ATPase, seguida pela re-extração de 1 × 1-partículas com partículas com tamanho de pixel de 0,88 Å/pixel. Para facilitar um alinhamento preciso das partículas, esta classe foi refinada no RELION2 usando uma máscara suave em torno do domínio ATPase e o domínio DNA-binding/cleavage produzindo um mapa de resolução global de 5,9 Å (ATPase-Core) (Suplemento 3).
Segundamente, realizamos uma classificação 3D focada do GyrA β-pinwheel com uma máscara suave e sem alinhamento no RELION2. Uma classe de 45.040 partículas com densidade bem definida do GyrA β-pinwheel foi selecionada, seguida pela re-extração de 1 × 1-pinwheel, produzindo partículas com tamanho de pixel de 0,88 Å/pixel. Esta classe foi refinada no RELION2 usando uma máscara suave em torno da roda de pinos β e o domínio de ligação/leavagem de DNA, produzindo um mapa de resolução 6,3 Å (CTD-Core) (Fig. 3 Complementar).
Finalmente, um auto-refinamento 3D focalizado foi realizado no RELION2 usando uma máscara suave em torno do domínio de ligação/leavagem de DNA. O pós-processamento do mapa produziu uma reconstrução de 4,3 Å resolução do domínio DNA-binding/cleavage. Em seguida, foi realizada uma classificação 3D focada do domínio DNA-binding/cleavage. Duas das classes mostraram melhor precisão angular e distintas conformações fechadas (60.548 partículas) e pré-abertura (53.655 partículas) do domínio DNA-binding/cleavage. Essas duas classes foram refinadas em RELION2 por refinamento 3D focado com simetria C2 usando 1 × 1 partículas encapsuladas e deram reconstruções com resolução global de 4,0 e 4,6 Å após o pós-processamento, respectivamente (Fig. 3 Suplementar). O domínio fechado de encadernação/colha de DNA foi ainda mais refinado pelo refinamento 3D focalizado usando uma máscara macia, o que exclui a inserção desordenada de TOPRIM produzindo um mapa 4.0 Å de alta qualidade (Suplemento Fig. 3).
Todas as resoluções relatadas são baseadas no critério padrão ouro FSC-0.14357 e as curvas FSC foram corrigidas para os efeitos de convolução de uma máscara macia usando uma subtituição de ruído de alta resolução58 no RELION2, bem como no cryoSPARC (Suplemento Fig. 4a). Todas as reconstruções foram afiadas através da aplicação de um fator B negativo que foi estimado utilizando procedimentos automatizados59. A resolução local dos mapas foi calculada usando Blocres60 (Suplemento Fig. 4c). Os mapas crio-EM do complexo geral, ATPase-core, CTD-core e o domínio de ligação/leavagem de DNA em estado fechado (com e sem inserção de TOPRIM) e em estado pré-abertura foram depositados no Banco de Dados EM sob os números de acesso EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, respectivamente.
Construção e refinamento do modelo
A reconstrução do EM do domínio de ligação/leavagem do DNA sem a inserção TOPRIM resolvida a 4.0 Å foi da melhor qualidade. Quase todas as cadeias laterais podiam ser vistas e a densidade da Gepotidacina era claramente visível. Este mapa foi utilizado para refinar uma estrutura cristalina do domínio de DNA ligante/preparação do E. coli DNA gyrase17. Um modelo atômico dimérico do domínio de ligação/cleavagem de DNA foi gerado usando PDB 3NUH em PyMol (Schrodinger L.L.C.). O modelo atômico subsequente foi despojado de aminoácidos pertencentes à inserção TOPRIM, todos os íons e moléculas de água, com todas as ocupações ajustadas a 1 e os fatores B ajustados a 50. Em primeiro lugar, o modelo atómico era de corpo rígido encaixado no mapa filtrado e afiado com Quimera61. Uma primeira rodada de refinamento de espaço real em PHENIX62 foi realizada utilizando o ajuste de espaço real local e o refinamento de minimização de gradiente global. Depois, 20 ácidos nucleicos da estrutura de S. aureus DNA gyrase41 (PDB 5IWM) foram copiados e ajustados em nosso modelo atômico. A sequência de ADN foi modificada de acordo com o ADN utilizado na nossa estrutura. Os resíduos de proteína ausentes e ácidos nucléicos foram construídos manualmente em COOT63. O modelo atômico e o dicionário de restrição de gepotidacina (GSK-2140944) foram gerados com o servidor Grade (http://grade.globalphasing.org). A gepotidacina foi então instalada manualmente na densidade de elétrons vazios em COOT e depois duplicada. Ambas as duplicatas foram configuradas para ocupação de 0,5. Foram realizadas várias rondas de refinamento de espaço real em PHENIX, utilizando restrições para estrutura secundária, rotamers, Ramachandran e simetria não cristalográfica, sempre seguidas de inspeção manual em COOT, até a obtenção de um modelo convergente. Finalmente, os fatores B foram refinados por uma rodada final de refinamento de espaço real em PHENIX, usando as mesmas configurações de antes. Após o refinamento ter convergido, as coordenadas atômicas da inserção TOPRIM foram adicionadas ao modelo atômico. Foi ainda refinado nas reconstruções do EM contendo a densidade de inserção em estados fechados e pré-abertos usando o mesmo procedimento. Uma validação cruzada de meio mapa foi realizada para definir 1,5 como o melhor peso de refinamento em PHENIX, permitindo a redução do choque atômico e a prevenção de sobreposição do modelo (Fig. 4e Suplementar). Todas as etapas de refinamento foram feitas usando o limite de resolução das reconstruções de acordo com o critério de padrão-ouro FSC-0.14357. Os parâmetros de refinamento, estatísticas do modelo e escores de validação estão resumidos na Tabela Complementar 2. Os modelos atómicos do domínio E. coli DNA-binding/cleavage em conformações fechadas (com e sem inserção) e pré-abertura foram depositados no Banco de Dados de Proteínas sob os números de acesso 6RKU, 6RKS, 6RKV, respectivamente.
Para o complexo global, utilizámos uma combinação de diferentes reconstruções de EM para construir o modelo atómico do complexo global de DNA gyrase. A estrutura ATPase-Core resolvida em 5,9 Å foi usada para o corpo rígido encaixar na Quimera a estrutura de cristal do domínio ATPase em complexo com ADPNP32 (PDB 1EI1) e o domínio DNA-binding/cleavage refinado em conformação fechada. A qualidade da densidade de elétrons permitiu construir em COOT os resíduos ausentes do linker entre o domínio ATPase e o domínio DNA-binding/cleavage. A estrutura do núcleo CTD resolvida a 6,3 Å foi utilizada para ajustar com precisão o corpo rígido à estrutura de cristal da roda de pinos β na Quimera. Os 10 aminoácidos em falta (564-574) seguindo a GyrA-box foram adicionados usando o servidor de modelagem Phyre264. A qualidade da densidade eletrônica permitiu construir em COOT os ácidos nucléicos ausentes em torno do β-pinwheel, bem como os 10 aminoácidos que ligam os últimos resíduos de GyrA à β-pinwheel. Com base em uma previsão de estrutura secundária, uma parte do ligador foi construída como uma hélice alfa (Fig. 3). O modelo atómico subsequente contendo o domínio ATPase, o domínio de ligação/leavagem de ADN e uma roda de pinos β foi rigidamente encaixado na estrutura global complexa resolvida a 6,6 Å utilizando Quimera. Em seguida, uma cópia da primeira roda de pino β foi encaixada na densidade da segunda roda de pino β em COOT. Os ácidos nucleicos em falta ao redor da segunda β-pinwheel, bem como os 10 resíduos do linker em falta foram construídos manualmente em COOT. O modelo atômico resultante foi despojado de todos os íons e moléculas de água, com todas as ocupações definidas para 1 e os fatores B definidos para 50. Finalmente, o refinamento de espaço real do modelo atômico contra a estrutura geral complexa foi realizado em PHENIX usando o refinamento de corpo rígido e de gradiente global. O limite de resolução para o refinamento foi definido de acordo com o critério de ouro FSC-0.14357. Também foram realizadas validações cruzadas de meio mapa (Fig. 4e Suplementar). Os parâmetros de refinamento, estatísticas do modelo e notas de validação estão resumidos na Tabela Complementar 2. O modelo atómico da estrutura global foi depositado no Banco de Dados de Proteínas sob os números de adesão 6RKW. Todas as figuras foram criadas com Quimera61, QuimeraX65 e PyMol (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q, e E264A purificação
O pET28b modificado usado para o tipo selvagem E. coli GyrB modificado foi mutado por mutagênese dirigida ao local usando o QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) a fim de gerar três plasmídeos abrigando as mutações R286K, R286Q, ou E264A (Tabela Suplementar 4). Os procedimentos de superexpressão e purificação dos três mutantes são idênticos ao GyrB do tipo selvagem descrito acima na seção Métodos.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q purificação
O pET28b modificado usado para o tipo selvagem T. thermophilus GyrB overexpression12 foi mutado por mutagênese dirigida ao local usando o kit QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) a fim de gerar dois plasmídeos abrigando as mutações K284R ou K284Q (Tabela Suplementar 4). Os procedimentos de sobreexpressão e purificação dos dois mutantes são idênticos ao GyrB do tipo E. coli selvagem descrito acima na seção Métodos.
Ensaio de superenrolamento do DNA
Uma concentração crescente de DNA gyrase (GyrA2B2) foi incubada a 37 °C com 6 nM de plasmídeo pUC19 relaxado em uma mistura de reação contendo 20 mM Tris-acetate pH 7,9, 100 mM acetato de potássio, 10 mM acetato de magnésio, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Após 30 min, as reações foram interrompidas pela adição de SDS 1%. A eletroforese em gel de agarose foi usada para monitorar a conversão da pUC19 relaxada para a forma super-revestida. Amostras foram analisadas em um gel de agarose 0,8%, 1X tampão Tris Borate EDTA (TBE), a 6 V/cm durante 180 min à temperatura ambiente. Os géis de agarose foram corados com brometo de etídio 0,5 mg/ml em 1X TBE durante 15 min, seguidos de 5 min de coloração em água. Os topoisômeros de DNA foram revelados usando um tufão (GE Healthcare).
ATPase activity assay
ATP hydrolysis is measured by following the oxidation of NADH mediated by piruvate kinase (PK) and lactate dehydrogenase (LDH). A absorvância foi monitorizada a 340 nm durante 600 s a 37 °C com um espectrofotómetro Shimadzu 1700. Reações foram registradas em triplicatas com 50-100 nM de GyrA2B2 e 16 nM de DNA linear (pCR-blunt) em 500 µl de um tampão contendo 50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM de acetato de potássio, 8 mM de acetato de magnésio, 7 mM BME, 100 µg/mg de BSA, 4U/5U de mistura PK/LDH, 2 mM PEP, e 0.2 mM NADH.
Alinhamento múltiplo e conservação evolutiva de resíduos
GyrB ATPase/Transducer seqüências de proteínas de 30 espécies (códigos Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) foram alinhados usando o Clustal Omega server (EMBL-EBI). O alinhamento subsequente foi utilizado para traçar a conservação evolutiva dos aminoácidos na estrutura ATPase/transdutor (PDB ID 1EI1) utilizando o servidor ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). A árvore filogenética foi gerada pelo método de união de vizinhos usando o alinhamento múltiplo no Clustal Omega.
Síntese do relatório
Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.