APL oferece serviços de análise em gel nativo desde 1998. Hoje muitos laboratórios infelizmente ignoram esta valiosa ferramenta porque pensam que os géis nativos são muito difíceis de usar, ou porque erroneamente acreditam que só podem ser usados com proteínas ácidas. Nos laboratórios Alliance Protein Laboratories, nós rotineiramente administramos géis nativos tanto em proteínas básicas quanto em proteínas ácidas. Nós ficaríamos felizes em executar amostras para você e/ou trabalhar com você para desenvolver um protocolo para uso em seu laboratório.
O que é um gel nativo?
“Nativo” ou “não desnaturalizador” eletroforese em gel é executado na ausência de SDS. Enquanto na SDS-PAGE a mobilidade electroforética das proteínas depende principalmente da sua massa molecular, na PAGE nativa a mobilidade depende tanto da carga da proteína como do seu tamanho hidrodinâmico.
A carga eléctrica que conduz a electroforese é regida pela carga intrínseca sobre a proteína no pH do tampão de funcionamento. Esta carga dependerá, naturalmente, da composição dos aminoácidos da proteína, bem como de modificações pós-tradução, como a adição de ácidos siálicos.
>Desde que a proteína mantenha a sua conformação dobrada, o seu tamanho hidrodinâmico e a mobilidade no gel também variará com a natureza desta conformação (maior mobilidade para conformações mais compactas, menor para estruturas maiores como oligómeros). Se a PAGE nativa é realizada perto do pH neutro para evitar a desnaturação ácida ou alcalina, então ela pode ser usada para estudar a conformação, auto-associação ou agregação, e a ligação de outras proteínas ou compostos.
Assim, os géis nativos podem ser sensíveis a qualquer processo que altere tanto a carga quanto a conformação de uma proteína. Isto torna-os excelentes ferramentas para detectar coisas como:
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alterações na carga devido à degradação química (por exemplo desamidação)
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não dobrado, “glóbulo fundido”, ou outras conformações modificadas
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oligómeros e agregados (tanto covalentes como não covalentes)
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eventos de ligação (proteína-proteína ou proteína-ligante)
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Estas propriedades, e seu rendimento relativamente alto, tornam os géis nativos excelentes ferramentas para analisar amostras de estabilidade acelerada, demonstrar a comparabilidade de diferentes lotes ou processos, ou examinar os efeitos dos excipientes.
Outra vantagem dos géis nativos é que é possível recuperar proteínas em seu estado nativo após a separação. A recuperação de materiais biológicos ativos pode, no entanto, precisar ser feita antes de qualquer fixação ou coloração.
Nota que os géis nativos que estão sendo discutidos aqui são agora às vezes chamados de géis “nativos claros”. Eles diferem em princípio dos chamados géis “nativos azuis”, que dependem da ligação do corante para dar à proteína uma carga elétrica muito alta, sobrecarregando a carga intrínseca no polipéptido. Se a quantidade de corante ligado é suposta ser proporcional à massa da proteína, então a mobilidade observada usando este protocolo “nativo azul” pode ser usada para estimar a massa molar, comparando com os padrões de proteína, muito como é feito para SDS-PAGE. Os padrões de massa vendidos para uso com géis nativos azuis não podem ser usados para estimar massas molares para os verdadeiros géis nativos que estão sendo discutidos aqui.