Infecção por papilomavírus humano de alto risco e expressão p16 no câncer de laringe

Subjetos

Este estudo envolveu 88 pacientes LC de tratamento-naïve sem metástase distante. Todos os pacientes foram diagnosticados com carcinoma epidermoide laríngeo por exame patológico de amostras e foram tratados no Departamento de Otorrinolaringologia, Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade de Ryukyus, entre Janeiro de 2008 e Dezembro de 2017. O prognóstico final dos pacientes foi julgado em julho de 2018. A classificação do estágio do tumor, nó, metástase (TNM) foi realizada de acordo com o Manual de Estadiamento da AJCC (7ª edição). Para determinar o estágio clínico e detectar múltiplos cânceres primários concomitantes, os pacientes foram submetidos a exames físicos e endoscópicos do trato gastrointestinal superior, inspeção ultra-sônica do pescoço, tomografia computadorizada (TC) e tomografia por emissão de fluorodeoxiglucose-positrons 18F.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade de Ryukyus e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 2008. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes LC antes da inscrição.

Tratamento

O principal tratamento para a lesão primária com intenção curativa foi radioterapia convencional (RT) isolada ou ressecção a laser em T1, quimioradioterapia simultânea (CCRT) em T2, CCRT ou cirurgia em T3 e cirurgia em T4, independentemente da presença do HPV. As lesões nodais foram tratadas com CCRT ou dissecção do pescoço combinada com a ressecção da lesão primária. Todos os pacientes que receberam RT (dose total, 70 Gy) tiveram o planejamento do tratamento com radioterapia tridimensional assistida na posição de tratamento com imobilização da máscara. O protocolo para o CCRT foi como relatado anteriormente. Quando o tumor primário em T3 não apresentou resposta parcial independentemente da resposta dos linfonodos do pescoço a 39,6 Gy, os pacientes foram submetidos à cirurgia curativa da lesão primária combinada com dissecção do pescoço.

Detecção do estado HPV e imunohistoquímica p16

Todas as amostras de tecido das lesões primárias sem qualquer radiação ou quimioterapia foram analisadas com a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para detecção do DNA do HPV usando amostras frescas congeladas, que foram obtidas na biopsia ou ressecção cirúrgica, e imunohistoquímica p16 usando amostras de FFPE. Casos com resultados negativos de detecção do HPV em PCR e sobreexpressão p16 (≥75% de células positivas e pelo menos moderada intensidade de coloração) foram ainda avaliados para o estado de HPV usando hibridação in situ (ISH) com sondas de DNA HPV (DNA ISH) . A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para carga viral e estado físico, como descrito abaixo, foi realizada em casos que abrigavam HPV-16 .

PCR para detecção de DNA HPV

Em resumo, o DNA foi isolado das amostras tumorais usando um Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). A presença e integridade do ADN foram verificadas em todas as amostras por PCR β-globina amplificação do gene usando os iniciadores PC04 e GH20 . Os primers de consenso geral GP5+/GP6+ e MY09/MY11 foram utilizados para analisar a presença de ADN HPV por PCR (Tabela 1) como descrito anteriormente . Além disso, as amostras de ADN negativas para PCR GP5+/GP6+ ou MY09/MY11 foram reamplificadas usando uma abordagem de PCR aninhada com o par de iniciadores GP5+/GP6+. Os produtos PCR do tamanho esperado (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) foram purificados e sequenciados directamente com um analisador genético ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). As sequências foram alinhadas e comparadas usando o programa BLAST com as dos tipos conhecidos de HPV na base de dados do GenBank.

Primeira tabela 1, usada neste estudo

p16 imunohistoquímica

Immunohistoquímica para p16 foi realizada usando um Kit de Histologia CINTec® p16 (Laboratórios MTM; Roche Applied Sciences, Penzberg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante . A imunomarcação foi visualizada por incubação em 3,3′-diaminobenzidina e lâminas coradas foram contra-manchadas com hematoxilina.

Os critérios de pontuação para imunoreatividade do p16 utilizados no presente estudo foram os seguintes: 0, sem coloração; 1, 1 – < 25% das células tumorais positivas para p16; 2, 25 – < 50% positivas; 3, 50 – < 75% positivas; 4, ≥75% positiva e fraca intensidade de coloração; e 5, ≥75% positiva e pelo menos moderada intensidade de coloração. O termo “p16 overexpression” (p16-positivo) foi definido como um escore de 5 no presente estudo.

ISH com sondas de DNA HPV

Biotinil tiramida-based ISH foi realizado usando a sonda de DNA biotinilado HPV GenPoint™ e o sistema de amplificação de sinal GenPoint para sondas biotiniladas de acordo com o protocolo do fabricante (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). A sonda de DNA biotinilado GenPoint HPV reage com os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, e 68 em secções de 4-μm de espessura de amostras de FFPE. A detecção da sonda hibridizada foi realizada utilizando o sistema de detecção GenPoint, de acordo com o protocolo do fabricante, com a peroxidase de estreptavidina-horseradish (HRP) primária incluída, biotinil tiramida, estreptavidina-HRP secundária e 3,3′-diaminobenzidina l (Dako; Agilent Technologies). As lâminas foram contra-manchadas com hematoxilina.

Estimativa da carga viral e estado físico do HPV-16 por qPCR

Para avaliar a carga viral e o estado físico do HPV-16, qPCR foi realizado como descrito anteriormente . Resumidamente, foram utilizados primers e sondas TaqMan visando os quadros de leitura aberta do HPV-16 E2 e E6 (Tabela 1). Os primers e as sondas reconhecem a região da dobradiça do E2, que é apagada na integração do HPV-16. Duas curvas padrão para os genes E2 e E6 foram criadas pela amplificação de 10 diluições em série (101, 102, 103, 104, 105 e 106 cópias virais) do plasmídeo pB-actin inicial, que foi um presente de Karl Munger, carregando a região completa do gene HPV-16 inicial (plasmídeo Addgene # 13711; Addgene, Cambridge, MA). A carga viral de DNA foi avaliada através do cálculo do número de cópias E6. Uma curva padrão externa foi criada usando diluições seriais conhecidas (0,3, 3, 30, e 300 ng) de DNA genômico humano (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para quantificação do DNA celular, e β-globina foi amplificada como descrito anteriormente. A quantidade de DNA foi calculada traçando os valores Cq contra o logaritmo da curva padrão. O estado físico do HPV-16 foi avaliado com base num método previamente publicado. Uma razão E2/E6 ≥ 1 indica a predominância da forma episomal, enquanto uma razão E2 número de cópias/total E6 < 1 indica a presença de ambas as formas integradas e episomais (forma mista).

Detecção da expressão do mRNA E6 por qPCR e RNA ISH em pacientes HPV-16-positivos com sobreexpressão p16

E6 expressão do mRNA foi detectada em amostras de pacientes identificados como HPV-16-positivos com sobreexpressão p16. O RNA total foi extraído de tecidos congelados usando RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total (500 ng) foi usado para sintetizar o cDNA do primeiro fio usando um Kit de Reagentes PrimeScript™ RT com Apagador de gDNA (Perfect Real Time; Takara Bio) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir a expressão HPV-16 E6 mRNA, o qPCR foi realizado usando o CFX96 Touch™ Sistema de detecção de PCR em Tempo Real (Bio-Rad, Hercules, CA) e TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Foram utilizados primers e sondas TaqMan (Tabela 1) que visam o gene HPV-16 E6 e o gene β-actin . A sonda β-actin foi rotulada com FAM no final de 5′ e com TAMRA no final de 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). As condições de amplificação foram: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C e um ciclo de 2 passos de 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 60 s, num total de 40 ciclos. Duas curvas padrão foram geradas para os genes E6 e β-actin por amplificação de diluições em série 10 vezes (101, 102, 103, 104, 105, e 106 cópias) do plasmídeo pB-actin inicial e do plasmídeo pCAG-mGFP-actin, que foi um presente de Ryohei Yasuda, carregando a região de codificação completa de β-actin (plasmídeo Addgene # 21948; Addgene). A expressão do gene E6 em cada amostra foi normalizada pela quantidade do controle interno β-actin.

RNA ISH para HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA foi realizada usando um RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, secções de 4-μm séries de amostras de FFPE foram desparafinizadas em xileno e reidratadas usando uma série de álcool graduado. A peroxidase endógena foi bloqueada com o Reagente de Peróxido de Hidrogênio RNAscope® à temperatura ambiente por 10 minutos. A recuperação do RNA alvo do HPV foi realizada no RNAscope® Target Retrieval Reagent a 100 °C durante 15 min. As lâminas foram digeridas com RNAscope® Protease Plus a 40 °C durante 30 min. A sonda HPV-16/- 18 E6/E7 RNA (RNAscope® Probe-HPV16/18) foi adicionada às seções e uma lamela foi aplicada. As lâminas foram transferidas para uma câmara umidificada para hibridação a 40 °C durante 2 h. Em seguida, as lamelas foram removidas e as lâminas foram lavadas com RNAscope® Wash Buffer Reagent a 40 °C. A amplificação do sinal foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A detecção da sonda hibridizada foi realizada utilizando 3.3′-diaminobenzidina (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). As lâminas foram contra-manchadas com hematoxilina. Lâminas de controle positivo (células de HeLa expressando HPV-18 E6/E7 mRNA) foram incluídas no RNA ISH. A coloração positiva foi identificada como pontos pontuais marrons vistos no núcleo e/ou citoplasma.

Análise estatística

Teste qui-quadrado da Pearson foi usado para comparar as características dos pacientes LC de acordo com o DNA do HPV e o estado de superexpressão p16. A sobrevida acumulada (SC) foi calculada usando o método de Kaplan-Meier e foi comparada entre dois grupos usando o teste de log-rank. Todas as análises foram realizadas com o pacote estatístico SPSS (SPSS, Versão 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 foi considerado significativo.

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