Subjetos
Este estudo envolveu 88 pacientes LC de tratamento-naïve sem metástase distante. Todos os pacientes foram diagnosticados com carcinoma epidermoide laríngeo por exame patológico de amostras e foram tratados no Departamento de Otorrinolaringologia, Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade de Ryukyus, entre Janeiro de 2008 e Dezembro de 2017. O prognóstico final dos pacientes foi julgado em julho de 2018. A classificação do estágio do tumor, nó, metástase (TNM) foi realizada de acordo com o Manual de Estadiamento da AJCC (7ª edição). Para determinar o estágio clínico e detectar múltiplos cânceres primários concomitantes, os pacientes foram submetidos a exames físicos e endoscópicos do trato gastrointestinal superior, inspeção ultra-sônica do pescoço, tomografia computadorizada (TC) e tomografia por emissão de fluorodeoxiglucose-positrons 18F.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade de Ryukyus e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 2008. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes LC antes da inscrição.
Tratamento
O principal tratamento para a lesão primária com intenção curativa foi radioterapia convencional (RT) isolada ou ressecção a laser em T1, quimioradioterapia simultânea (CCRT) em T2, CCRT ou cirurgia em T3 e cirurgia em T4, independentemente da presença do HPV. As lesões nodais foram tratadas com CCRT ou dissecção do pescoço combinada com a ressecção da lesão primária. Todos os pacientes que receberam RT (dose total, 70 Gy) tiveram o planejamento do tratamento com radioterapia tridimensional assistida na posição de tratamento com imobilização da máscara. O protocolo para o CCRT foi como relatado anteriormente. Quando o tumor primário em T3 não apresentou resposta parcial independentemente da resposta dos linfonodos do pescoço a 39,6 Gy, os pacientes foram submetidos à cirurgia curativa da lesão primária combinada com dissecção do pescoço.
Detecção do estado HPV e imunohistoquímica p16
Todas as amostras de tecido das lesões primárias sem qualquer radiação ou quimioterapia foram analisadas com a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para detecção do DNA do HPV usando amostras frescas congeladas, que foram obtidas na biopsia ou ressecção cirúrgica, e imunohistoquímica p16 usando amostras de FFPE. Casos com resultados negativos de detecção do HPV em PCR e sobreexpressão p16 (≥75% de células positivas e pelo menos moderada intensidade de coloração) foram ainda avaliados para o estado de HPV usando hibridação in situ (ISH) com sondas de DNA HPV (DNA ISH) . A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para carga viral e estado físico, como descrito abaixo, foi realizada em casos que abrigavam HPV-16 .
PCR para detecção de DNA HPV
Em resumo, o DNA foi isolado das amostras tumorais usando um Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). A presença e integridade do ADN foram verificadas em todas as amostras por PCR β-globina amplificação do gene usando os iniciadores PC04 e GH20 . Os primers de consenso geral GP5+/GP6+ e MY09/MY11 foram utilizados para analisar a presença de ADN HPV por PCR (Tabela 1) como descrito anteriormente . Além disso, as amostras de ADN negativas para PCR GP5+/GP6+ ou MY09/MY11 foram reamplificadas usando uma abordagem de PCR aninhada com o par de iniciadores GP5+/GP6+. Os produtos PCR do tamanho esperado (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) foram purificados e sequenciados directamente com um analisador genético ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). As sequências foram alinhadas e comparadas usando o programa BLAST com as dos tipos conhecidos de HPV na base de dados do GenBank.
p16 imunohistoquímica
Immunohistoquímica para p16 foi realizada usando um Kit de Histologia CINTec® p16 (Laboratórios MTM; Roche Applied Sciences, Penzberg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante . A imunomarcação foi visualizada por incubação em 3,3′-diaminobenzidina e lâminas coradas foram contra-manchadas com hematoxilina.
Os critérios de pontuação para imunoreatividade do p16 utilizados no presente estudo foram os seguintes: 0, sem coloração; 1, 1 – < 25% das células tumorais positivas para p16; 2, 25 – < 50% positivas; 3, 50 – < 75% positivas; 4, ≥75% positiva e fraca intensidade de coloração; e 5, ≥75% positiva e pelo menos moderada intensidade de coloração. O termo “p16 overexpression” (p16-positivo) foi definido como um escore de 5 no presente estudo.
ISH com sondas de DNA HPV
Biotinil tiramida-based ISH foi realizado usando a sonda de DNA biotinilado HPV GenPoint™ e o sistema de amplificação de sinal GenPoint para sondas biotiniladas de acordo com o protocolo do fabricante (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). A sonda de DNA biotinilado GenPoint HPV reage com os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, e 68 em secções de 4-μm de espessura de amostras de FFPE. A detecção da sonda hibridizada foi realizada utilizando o sistema de detecção GenPoint, de acordo com o protocolo do fabricante, com a peroxidase de estreptavidina-horseradish (HRP) primária incluída, biotinil tiramida, estreptavidina-HRP secundária e 3,3′-diaminobenzidina l (Dako; Agilent Technologies). As lâminas foram contra-manchadas com hematoxilina.
Estimativa da carga viral e estado físico do HPV-16 por qPCR
Para avaliar a carga viral e o estado físico do HPV-16, qPCR foi realizado como descrito anteriormente . Resumidamente, foram utilizados primers e sondas TaqMan visando os quadros de leitura aberta do HPV-16 E2 e E6 (Tabela 1). Os primers e as sondas reconhecem a região da dobradiça do E2, que é apagada na integração do HPV-16. Duas curvas padrão para os genes E2 e E6 foram criadas pela amplificação de 10 diluições em série (101, 102, 103, 104, 105 e 106 cópias virais) do plasmídeo pB-actin inicial, que foi um presente de Karl Munger, carregando a região completa do gene HPV-16 inicial (plasmídeo Addgene # 13711; Addgene, Cambridge, MA). A carga viral de DNA foi avaliada através do cálculo do número de cópias E6. Uma curva padrão externa foi criada usando diluições seriais conhecidas (0,3, 3, 30, e 300 ng) de DNA genômico humano (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para quantificação do DNA celular, e β-globina foi amplificada como descrito anteriormente. A quantidade de DNA foi calculada traçando os valores Cq contra o logaritmo da curva padrão. O estado físico do HPV-16 foi avaliado com base num método previamente publicado. Uma razão E2/E6 ≥ 1 indica a predominância da forma episomal, enquanto uma razão E2 número de cópias/total E6 < 1 indica a presença de ambas as formas integradas e episomais (forma mista).
Detecção da expressão do mRNA E6 por qPCR e RNA ISH em pacientes HPV-16-positivos com sobreexpressão p16
E6 expressão do mRNA foi detectada em amostras de pacientes identificados como HPV-16-positivos com sobreexpressão p16. O RNA total foi extraído de tecidos congelados usando RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total (500 ng) foi usado para sintetizar o cDNA do primeiro fio usando um Kit de Reagentes PrimeScript™ RT com Apagador de gDNA (Perfect Real Time; Takara Bio) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir a expressão HPV-16 E6 mRNA, o qPCR foi realizado usando o CFX96 Touch™ Sistema de detecção de PCR em Tempo Real (Bio-Rad, Hercules, CA) e TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Foram utilizados primers e sondas TaqMan (Tabela 1) que visam o gene HPV-16 E6 e o gene β-actin . A sonda β-actin foi rotulada com FAM no final de 5′ e com TAMRA no final de 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). As condições de amplificação foram: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C e um ciclo de 2 passos de 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 60 s, num total de 40 ciclos. Duas curvas padrão foram geradas para os genes E6 e β-actin por amplificação de diluições em série 10 vezes (101, 102, 103, 104, 105, e 106 cópias) do plasmídeo pB-actin inicial e do plasmídeo pCAG-mGFP-actin, que foi um presente de Ryohei Yasuda, carregando a região de codificação completa de β-actin (plasmídeo Addgene # 21948; Addgene). A expressão do gene E6 em cada amostra foi normalizada pela quantidade do controle interno β-actin.
RNA ISH para HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA foi realizada usando um RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, secções de 4-μm séries de amostras de FFPE foram desparafinizadas em xileno e reidratadas usando uma série de álcool graduado. A peroxidase endógena foi bloqueada com o Reagente de Peróxido de Hidrogênio RNAscope® à temperatura ambiente por 10 minutos. A recuperação do RNA alvo do HPV foi realizada no RNAscope® Target Retrieval Reagent a 100 °C durante 15 min. As lâminas foram digeridas com RNAscope® Protease Plus a 40 °C durante 30 min. A sonda HPV-16/- 18 E6/E7 RNA (RNAscope® Probe-HPV16/18) foi adicionada às seções e uma lamela foi aplicada. As lâminas foram transferidas para uma câmara umidificada para hibridação a 40 °C durante 2 h. Em seguida, as lamelas foram removidas e as lâminas foram lavadas com RNAscope® Wash Buffer Reagent a 40 °C. A amplificação do sinal foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A detecção da sonda hibridizada foi realizada utilizando 3.3′-diaminobenzidina (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). As lâminas foram contra-manchadas com hematoxilina. Lâminas de controle positivo (células de HeLa expressando HPV-18 E6/E7 mRNA) foram incluídas no RNA ISH. A coloração positiva foi identificada como pontos pontuais marrons vistos no núcleo e/ou citoplasma.
Análise estatística
Teste qui-quadrado da Pearson foi usado para comparar as características dos pacientes LC de acordo com o DNA do HPV e o estado de superexpressão p16. A sobrevida acumulada (SC) foi calculada usando o método de Kaplan-Meier e foi comparada entre dois grupos usando o teste de log-rank. Todas as análises foram realizadas com o pacote estatístico SPSS (SPSS, Versão 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 foi considerado significativo.