O ensaio de migração transwell é uma técnica clássica que permite aos cientistas quantificar o movimento celular. A migração refere-se à capacidade de uma célula de se mover individualmente ou em grupos. Os movimentos celulares são possíveis através da reestruturação precisa de seu citoesqueleto e a migração geralmente ocorre em resposta a estímulos que atuam como taco.
Hoje, vamos discutir o ensaio de migração transwell, que utiliza uma simples configuração de câmara para avaliar a migração em resposta à atração de taco.
Vamos começar por fornecer algumas informações sobre a câmara transwell.
O aparelho foi desenhado pelo Dr. Stephen Boyden em 1961, que o usou para estudar a migração de leucócitos. Portanto, este método também é conhecido como ensaio de câmara de Boyden.
Numa simples câmara de Boyden, a parede externa é dos poços, como os de uma placa de 96 poços. Dentro de cada poço, é colocado um transwell, que é um inserto cilíndrico. O inserto tem uma membrana de policarbonato de tamanho de poro definido. Quando colocado no poço, ele divide a câmara em dois compartimentos. O compartimento superior é onde as células cujo comportamento migratório deve ser estudado serão semeadas, e o reservatório inferior é onde a solução de quimiotractor é colocada. Por definição, um quimiotractor é uma molécula que tem a capacidade de promover a motilidade celular “atraindo células”,
De acordo com estas forças atractivas, as células do compartimento superior migram através dos poros para o reservatório inferior. Se as células tiverem propriedades aderentes, como algumas células de melanoma, após o movimento elas “grudarão” no lado inferior da membrana. Neste caso, a membrana pode ser fixada, corada e as células podem ser contadas sob o microscópio. Por outro lado, as células não aderentes, como os espermatozóides, migrarão para o reservatório inferior. Neste caso, as células na solução do reservatório podem ser contadas com a ajuda de um hemocitômetro.
Embora o ajuste para este ensaio seja simples, há várias coisas que você precisa considerar antes do experimento. Vamos rever algumas delas.
Começando com a solução de semeadura, você tem que ter certeza que a densidade está otimizada para observar a migração celular. Muito poucas células podem resultar em migração indetectável, e densidades maiores irão sobrepovoar a membrana, tornando difícil enumerar a migração. A segunda consideração é o tamanho do poro da inserção. Ele deve ser cuidadosamente escolhido dependendo do tipo de célula. Se o tamanho do poro for muito pequeno, as células serão incapazes de passar através.
Alternativamente, se o tamanho do poro for muito grande, as células simplesmente cairão, o que não é migração. Finalmente, é preciso estar atento à concentração de quimiotracto e ao tempo de incubação para permitir a migração, pois estes são inter-dependentes. A concentração ótima com tempo de incubação adequado, durante o qual o gradiente de concentração é mantido entre os compartimentos, induz a migração celular devido à quimiotração. Por outro lado, incubações prolongadas podem ser acompanhadas por um equilíbrio do quimioattrato em toda a câmara levando à perda do gradiente químico, o que pode confundir a análise dos resultados obtidos.
Com estas considerações em mente, vamos discutir um protocolo usado para medir a migração das células aderentes.
Células a serem testadas são preparadas em um meio livre de proteases, uma vez que proteases podem desnaturar receptores de membrana importantes, e finalmente afetar a migração. Depois das células serem preparadas, a suspensão deve ser diluída até uma densidade de sementeira óptima. A fim de preparar a câmara, as transwells são colocadas em poços numa placa de múltiplos poços. A suspensão celular deve ser pipetada para o poço de transferência sem tocar na membrana ou introduzir bolhas de ar.
Solução quimioatractante é pipetada para o reservatório inferior, certificando-se que a solução toca na membrana do inserto. O tempo de incubação para a migração dependerá das considerações experimentais. Após a incubação, as membranas são fixadas por imersão do inserto em etanol a 70%. Após deixar o inserto secar, a solução de coloração celular é adicionada.
Next, as células são incubadas durante aproximadamente 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, os insertos são lavados com a ajuda de tampão de lavagem. Finalmente, a membrana pode ser excisada e colocada sobre uma lâmina de microscópio. As células na parte inferior da membrana representam o número de células que migraram na presença e ausência de quimiotractantes.
Desde que agora você tem uma idéia do protocolo, vamos dar uma breve olhada em como os pesquisadores estão usando este método em suas explorações.
Uma das aplicações mais comuns deste ensaio é avaliar as propriedades quimiotractantes de compostos desconhecidos. Aqui, os cientistas estavam interessados em examinar as vias de natação de esperma de rã na presença de alurina, que é uma substância secretada por ovos de anfíbios. Para isso, pipetaram primeiro os espermatozóides activos de rãs para a parte superior das inserções de transwell. Na parte inferior, eles adicionaram alurina. Depois de permitir a migração das células, eles contaram o esperma na solução do reservatório sob um microscópio. Usando esta técnica, eles foram capazes de gerar uma curva concentração-resposta retratando o efeito da concentração de allurina na migração do esperma.
Quando uma célula é atacada por patógenos, ela envia quimiotractantes para recrutar células imunes que migram, anexam, e subsequentemente resolvem a infecção. Para testar este fenómeno, estes cientistas cultivaram células epiteliais na parte inferior das inserções. Subsequentemente, infectaram estas células com diferentes estirpes de bactérias. Finalmente, eles introduziram células imunes na câmara superior. Sabe-se que as células infectadas produzem vários quimiotractantes que induzem a migração das células imunitárias. Os resultados desta experiência demonstraram diferentes graus de migração dos neutrófilos em resposta a diferentes tipos de infecção bacteriana.
A última invasão e metástase das células cancerígenas através da matriz extracelular sempre intrigou os biólogos celulares. Aqui, os cientistas quiseram determinar como quimiotractantes específicos podem contribuir para tal migração através de uma matriz 3D. Eles criaram geneticamente dois grupos separados de células: um expressando fluorescente verde, e outro fluorescente vermelho, proteína. Eles então pipetaram uma matriz-mimica extracelular para o topo de transwells.
Once solidificado, eles inverteram o transwell e semearam dois pools de células para o lado inferior da membrana. Em seguida, eles substituíram a inserção na placa multipoços e pipetaram a solução quimiotrativa para a câmara superior. Isto fez com que as células na parte inferior se movessem para cima e através da matriz 3D. Com a ajuda de imagens confocais, estes pesquisadores reconstruíram a migração celular em 3D, e distinguiram os padrões de migração de dois grupos de células.
Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre o ensaio de migração transwell. Com a compreensão dos componentes e do protocolo deste método, você agora sabe porque ele é tão amplamente utilizado pelos biólogos celulares. Apesar da simplicidade desta configuração, a gama de configurações que este método pode adaptar torna-o indispensável para os estudos de motilidade celular. Como sempre, obrigado por observar!