A observação de que a imunoneutralização da somatostatina aumentou o volume basal e a saída de amilase em um modelo isolado de pâncreas de rato, sugere uma fonte intrapancreática de somatostatina. Esta somatostatina pancreática poderia, portanto, causar uma inibição tônica da secreção pancreática exócrina (97). Em ratos conscientes com secreções biliares e pancreáticas devolvidas ao intestino, a somatostatina iv (5 µg kg-1 h-1) inibiu a proteína pancreática basal e a secreção de fluidos em 84 e 64%, respectivamente; a adição de atropina ip (500 µg kg-1 h-1) não causou inibição adicional (51). Em ratos anestesiados, a secreção basal de amilase foi significativamente inibida por uma infusão de somatostatina em dose relativamente alta de 100 µg 100 g-1 h-1. Entretanto, quando administrada como injeção em bolus de 50 µg 100 g-1 BW, a liberação de amilase aumentou quatro vezes durante 20 min (39). Num estudo anterior (25), a somatostatina administrada em doses de 0,4 a 25 µg kg-1 h-1 a ratos da fístula consciente resultou em diminuições dependentes da dose no fluxo basal, bicarbonato e libertações de proteínas. Nas doses mais elevadas, a saída de proteína foi reduzida em 80%, bicarbonato em 63% e fluxo em 42%. Em ratos anestesiados com uretano, um aumento inicial em todos os parâmetros pancreáticos foi observado nos dois primeiros minutos, seguido por uma diminuição de 30 a 40% na produção protéica. Nessas condições, a somatostatina teve que atingir a dose de 100 µg kg-1 h-1 para afetar a liberação de bicarbonato basal. Estes dados sobre a secreção pancreática basal de fluido e proteínas indicam que o efeito inibitório da somatostatina parece específico da espécie e sensível à anestesia, como mostrado anteriormente (17). Quando ratos foram infundidos intraduodenalmente com SS-14 nas doses de 12 a 96 µg kg-1 h-1, o volume total basal e a saída de proteína não foram afetados; estes resultados poderiam indicar que a somatostatina duodenal luminal não influencia a secreção pancreática basal diretamente ou através da liberação basal de CCK e secretino (126). Ao contrário do rato, a infusão de IV de SS-28 a 400 ng kg-1 h-1 inibiu totalmente a secreção de líquido basal e proteína no cão consciente (147). Também em cães preparados com fístulas gástricas e pancreáticas, a somatostatina-14 a 2,5 µg kg-1 h-1 inibiu o volume basal e a saída de proteína em mais de 90% (146).
Em humanos, a estimulação pancreática por administração intraduodenal de triptofano ou uma mistura de aminoácidos foi atenuada por SS-28 exógena (58). Em outros estudos no homem, a secreção enzimática pancreática pós-prandial inibida pelo octreotídeo (81). No cão, SS-14 dado como iv bolus a 3,5 µg kg-1 seguido por infusão a 3,5 µg kg-1 h-1 causou reduções significativas das atividades duodenais de tripsina e amilase durante um teste de estimulação de refeição (70). No rato, o octreotídeo inibiu significativamente o volume pancreático, bicarbonato, amilase e níveis séricos de secreção e CCK em resposta ao ácido oléico intraduodenal, um liberador de CCK (137).
Em voluntários saudáveis (30), o suco pancreático puro foi obtido pela canulação endoscópica do ducto pancreático principal. Em resposta à secreção sintética (0,06 CU kg-1 h-1), a concentração de bicarbonato no suco pancreático atingiu níveis de 117 µEq ml-1 após 10 min e um fluxo de suco de 7,3 ml/5 min após 15 min de infusão de secreção. SS-14 levou a uma diminuição de 47% no fluxo pancreático após 10 min e de 67% após 15 min. As concentrações de bicarbonato e proteínas no suco pancreático mostraram apenas uma tendência à diminuição na dose de somatostatina de 5 µg kg-1 h-1. Também em humanos, a secreção enzimática pancreática, mas não a secreção de bicarbonato, estimulada pela secreção (250 ng kg-1/20 min) e caeruleína (25 ng kg-1/20 min) foi inibida pela SMS 201-995 de forma dose-independente (73). Em cães conscientes (147), a secreção de fluido e bicarbonato estimulado pela secretino (1 CU kg-1 h-1) foi ligeiramente afetada por doses maiores de SS-28 (400 ng kg-1 h-1). Na mesma dose, a saída de proteína estimulada pela caeruleína foi significativamente inibida. Em ratos anestesiados, a somatostatina linear 14 administrada a 100 µg/100 g-1 h-1 causou uma forte inibição da amilase pancreática e liberação de tripsina estimulada por 3 unidades caninas IVY/100 g-1 h-1 de CCK com um rápido ricochete destas secreções uma vez terminada a infusão de somatostatina (39). Em ratos conscientes com desvio do suco pancreático (51) que causou fortes aumentos nas secreções de proteínas e fluidos, todas as cinco doses de octreotídeo infundido (5,20,80,320 e 1280 ng kg-1 h-1) inibiram significativamente a secreção de proteínas e fluidos com IC50 de 40 e 60 ng kg-1 h-1, respectivamente. A inibição máxima de proteínas e fluidos atingiu 90% e 75% respectivamente, na dose de 1,28 µg kg-1 h-1. SS-14 quando comparado ao seu octreotídeo análogo tinha uma IC50 de 0,7 µg kg-1 h-1 para secreção de proteína e 1,2 µg kg-1 h-1 para secreção de fluido, com um efeito inibitório máximo obtido a 25 µg kg-1 h-1 tanto para a proteína como para a secreção de fluido. Esses dados indicam que o octreotídeo é 20 vezes mais potente que o SS-14 na inibição da proteína pancreática e da secreção volêmica estimulada pelo desvio do suco pancreático.
Estudos in vitro
As enzimas pancreáticas e a secreção fluida in vivo é a soma de numerosos processos fisiológicos complexos que incluem a interação de hormônios endócrinos e parácrinos, bem como a estimulação e a liberação de neurotransmissores. Devido a estas múltiplas interacções, é muitas vezes difícil avaliar se um composto que inibe a secreção pancreática in vivo afecta directamente as funções das células acinar e ductal ou altera a libertação de secretagogues. Portanto, o pâncreas perfurado isolado, as preparações isoladas de células acinares e ductais e as culturas celulares de ambos os tipos de células podem dar respostas a algumas destas questões.
As células acinarinas pancreáticas possuem receptores específicos para somatostatina-14 e 28 (124.166) que permanecem presentes após as preparações celulares (40). Também tem sido relatado que no pâncreas cão perfundido isolado, a glândula pode tomar até 50-80% de somatostatina perfundida em uma faixa de concentração de 20 a 4000 pg ml-1 comparado a menos de 21% de insulina ou glucagon (71). Esta observação foi posteriormente confirmada com a extração de SS-14 pelo pâncreas in situ do cão, em média superior a 50% comparado a menos de 17% para o glucagon (152). Todas essas observações nos permitem acreditar que a somatostatina deve ser capaz de inibir diretamente a secreção enzimática pancreática estimulada neural ou hormonal in vitro usando as preparações celulares acima citadas.
Apesar de muitos estudos, o efeito inibitório da SS-14 e da SS-28 na liberação de enzimas estimuladas a partir de acinis pancreáticos isolados ainda é controverso. Para entender alguns desses resultados opostos, pode ajudar a fazer uma distinção entre o efeito da SS na estimulação onde o agonista como VIP trabalha através do cAMP, onde a SS inibe e agonistas como CCK onde alguns investigadores observaram um efeito inibitório e outros não. Na cobaia perfundida, o perfil cinético da liberação de amilase em resposta à VIP foi significativamente diminuído pelo SS (100 nM) (140). Por outro lado, octreotídeo (100 nM) inibiu significativamente a liberação sinérgica de amilase estimulada por secretino + CCK-8 ou por VIP + CCK-8 (65). A somatostatina também inibiu o efeito da cAMP sobre a secreção de amilase induzida pelo cálcio dos acinídeos pancreáticos de ratos, deslocando a curva dose-resposta para a direita (99), outro exemplo de SS agindo através da via de cAMP.
Muitos outros estudos, entretanto, mostram claramente que a somatostatina não tem efeitos inibidores sobre o pâncreas exócrino in vitro, seja sobre o pâncreas perfurado isolado, os ácinos isolados ou as preparações lobulares isoladas nas quais o CCK foi o estímulo (65,96,99,139,158). No pâncreas de rato isolado (43), a insulina exógena (10 mU ml-1) potenciou significativamente a CCK e a secreção de amilase estimulada por carbachol, uma potenciação inibida significativamente pela SS. A ausência de efeito inibitório direto da SS também foi observada em células parietais caninas isoladas (106). De fato, a SS a 1 µM não conseguiu inibir a resposta secretora gástrica à histamina, metacolina e pentagastrina, suportando alguns dos dados acima mencionados. Curiosamente, a SS-28 na alta concentração de 10 µM foi capaz de estimular a liberação de amilase a partir do acínio pancreático de cobaia a cerca de 68% daquele estimulado pela caeruleína de 100 pM. Uma resposta secretora máxima idêntica à iniciada pela caeruleína também foi obtida por dois análogos SS-28, Nat S1-28 e SS28. Nessas condições, a SS-14 não teve efeito estimulante (33). Como explicação para este efeito secretor do SS-28 sobre os acini, foi proposto que o SS-28 pode interagir com o receptor CCK em altas concentrações (34), um efeito inibido pelo DBcGMP, um antagonista do receptor CCK (105). Por outro lado, a falha do SS-14 em inibir a secreção enzimática estimulada do acini isolado pode resultar na liberação no meio de incubação de uma protease ativa, observada primeiramente no suco pancreático secretado, e capaz de degradar o SS-14 (127). Esta protease serina foi purificada para homogeneidade a partir do suco pancreático puro de rato. Com um MW de aproximadamente 29 kDa, corresponde à elastase pancreática II de rato. Portanto, se secretada no meio de incubação, degradaria o SS-14 e evitaria qualquer um de seus efeitos inibitórios e assim explicaria parcialmente porque o SS-14 não foi capaz de mostrar seus efeitos inibitórios na liberação de enzimas in vitro (151). Também pode afetar a resposta secretora ao SS-28 em concentrações mais baixas no meio de incubação. Outra possibilidade pode ser que os agentes de mobilização celular do cálcio diminuam a afinidade dos receptores de somatostatina das células acinares para a somatostatina (33).
Efeitos sobre o crescimento
O crescimento normal de um organismo resulta em um equilíbrio complexo dos hormônios envolvidos, como o hormônio do crescimento, insulina e hormônios da tireóide. Como a somatostatina pode inibir a liberação de muitos hormônios, sua neutralização deve estimular sua secreção e assim aumentar o crescimento. Esta abordagem de auto-imunização contra a somatostatina para estimular o crescimento tem sido testada em cordeiros. Quando foram obtidos títulos significativos de anticorpos, a taxa de ganho de peso foi maior em animais imunizados com SS e acompanhada de aumento de altura. Nestes cordeiros imunizados, houve uma maior resposta hormonal de crescimento à estimulação com arginina, assim como níveis basais mais elevados de somatomedina no sangue (143). Estes dados foram posteriormente confirmados também nesta espécie (75). Quando administrada a ratos implantados subcutaneamente com uma mini-bomba Alzet, a somatostatina administrada a 1,5 µg h-1 durante 14 dias não teve efeito no seu ganho de peso. Entretanto, a infusão de um antagonista da somatostatina levou a um aumento significativo no ganho de peso sobre o controle (144).
No rato, a injeção diária de somatostatina-14 a 390 µg kg-1 dia-1 em gelatina durante três semanas não teve efeito sobre o peso corporal, mas reduziu as densidades parietal e de células pépticas por milímetro cúbico em comparação com os controles. No entanto, antagonizou o efeito promotor do crescimento exógeno (130 µg kg-1 dia-1) e da libertação de gastrina endógena após a transposição do antro para o cólon, causando hipergastrinemia. Nestes animais translocados para o antro, o aumento do peso pancreático foi significativamente reduzido pela somatostatina (400 µg kg-1 dia-1) durante 3 semanas (80). Durante um período de 5 dias, a somatostatina-14 s.c. em gelatina nas doses de 11, 33 ou 100 µg kg-1 a cada 8 h causou diminuições significativas das concentrações de amilase pancreática, quimotripsina e proteína e do conteúdo total de DNA apenas nas duas doses mais altas, sem qualquer efeito sobre o peso pancreático total. Entretanto, as taxas de proteína, RNA e síntese de DNA foram significativamente reduzidas imediatamente após cada injeção de somatostatina durante 24 h (92). A somatostatina-14, também administrada s.c. em gelatina na dose de 600 µg kg-1, três vezes ao dia durante 2 e 4 dias, reduziu significativamente os efeitos tróficos da caeruleína (1 µg kg-1, três vezes ao dia) com um forte efeito no conteúdo total de ADN. Curiosamente, a imunoneutralização contra SS-14 aumentou significativamente todos os parâmetros de crescimento estudados acima daqueles observados em resposta à caeruleína (93). Efeitos inibitórios similares foram observados com a administração prolongada de somatostatina de ação prolongada, SMS 201-995 (54). O desvio do suco pancreático no rato causa liberação significativa de CCK endógena resultando em aumento do crescimento pancreático (89). Usando este procedimento de desvio do suco biliar-pancreático, tal técnica aplicada 8 h dia-1 por 4 dias levou a aumentos significativos no peso pancreático e soro CCK; ambos efeitos foram significativamente reduzidos pelo SMS 201-995 infundido na dose de 5 µg kg-1 h-1 e por L-364.718, um antagonista do receptor CCK-1, administrado na dose de 0,5 mg kg-1 h-1. Nestas condições, tanto o SMS como o L-364.718 foram equipotentes na redução do crescimento do pâncreas, enquanto o SMS foi o único antagonista capaz de reduzir a um nível basal o CCK endógeno liberado pelo desvio pancreático-bilíaco (119). Esses dados indicam que somatostatina e análogos podem reduzir o crescimento do pâncreas estimulado por CCK exógeno e liberado endogenamente. Finalmente, observou-se que a somatostatina (SMS) infundida a uma taxa de 5 µg kg-1 h-1 durante 2 dias foi capaz de prevenir totalmente o aumento de 70% do peso pancreático induzido pela caseína e o conteúdo total de RNA e DNA (94). Esta é outra evidência de que a somatostatina pode controlar o crescimento induzido do pâncreas estimulado pela CCK endógena liberada por uma dieta rica em proteínas (50). Dada isoladamente como uma infusão de iv durante 7 dias na dose de 5 µg kg-1 h-1, a SMS 201-995 causou reduções significativas no peso pancreático e intestinal acompanhadas por diminuições no DNA total e no RNA em ambos os órgãos. Plasma CCK e IGF-1 foram reduzidos enquanto o conteúdo total de IGF-1 no pâncreas foi aumentado (120). Além do CCK endógeno, algumas observações sugerem o possível envolvimento do IGF-1 no processo de controle positivo do crescimento do intestino e do pâncreas. De fato, esse fator de crescimento está presente no intestino (28) e no pâncreas (56) e receptores específicos foram documentados nas células desses órgãos (76.162); mecanismos de ação parácrinos ou autócrinos foram postulados (29). A Somatostatina pode atuar no controle desses dois órgãos através de uma inibição da liberação de IGF-1 acompanhada de um efeito semelhante no CCK intestinal.
Efeitos da Somatostatina sobre os tumores pancreáticos
Somatostatina tem sido caracterizada como o “interruptor universal de desligamento”, pois inibe a maioria das funções dos órgãos e células às quais tem sido associada. Um papel para a somatostatina e seus análogos no tratamento do câncer pancreático tem sido sugerido porque essas moléculas inicialmente forneceram terapia adjuvante positiva não tóxica.
No hamster sírio dourado implantado subcutaneamente com células adenocarcinoma pancreático ductal WD, um tratamento crônico de 21 dias com a somatostatina análoga (L-5-Br-Trp8)SS na dose de 20 µg a.i.d., diminuiu o peso do tumor em 44% e o volume do tumor em 22% (114). A somatostatina e seu RC-160 analógico também demonstraram inibir alterações pré-neoplásicas e diminuir a incidência de tumores em hamsters expostos ao carcinógeno pancreático BOP; estes tratamentos causaram aumentos no número de células tumorais apoptóticas (150). Em outro estudo, o número de receptores de somatostatina aumentou nas células tumorais após o tratamento RC-160 (35). O crescimento de células MIAPaCa-2 implantadas s.c. em camundongos nus foi dose-dependentemente inibido por injeções de octreotídeo duas vezes ao dia a 250 e 2500 µg kg-1 (160). Usando outro modo de administração do medicamento, microcápsulas, RC-160 administradas a 1250 µg kg-1 d-1 inibiram significativamente o crescimento dos tumores de MIAPaCa-2 em camundongos nus (110). A falha da somatostatina ou de seus análogos para inibir o crescimento do tumor poderia ter resultado da ausência do receptor de SS, como mostrado nas células do pâncreas humano PGER, que são irresponsáveis ao SMS 201-995 (141). Em MIAPaCa-2 e PANC-1 células cultivadas em DMEM contendo 10% de soro de bezerro fetal, 1 µM SS-14 e SMS 201-995 inibiram o crescimento das células PANC-1 com ativação da tirosina fosfatase SHP-1. Pelo contrário, SS e seu análogo causaram o crescimento da célula MIAPaCa-2 e este efeito de crescimento pode ter resultado da ausência de SHP-1 nestas células (31). Nas células respondendo à somatostatina, foi mostrado anteriormente que a SHP-1 co-purificada com o receptor de somatostatina (167). Um efeito semelhante de estimulação do crescimento de SMS foi observado em células BON (células carcinoides do pâncreas humano) na dose de 1 nM e 100 nM; este efeito de crescimento foi acompanhado por reduções significativas no conteúdo de AMPcélulas sem afetar a hidrólise da PI (66).
Os ensaios clínicos com análogos de somatostatina no tratamento adjuvante do câncer pancreático falharam em demonstrar uma resposta. Nenhum efeito antitumoral foi observado em 14 pacientes com câncer pancreático metastático com três injeções diárias de 100-200 µg de s.c. durante 7 semanas (72). Em outro estudo, 19 pacientes com carcinoma pancreático exócrino avançado receberam a somatostatina analógica BIM23014 de 250 µg a 1 mg dia-1 durante 2 meses. Dentro deste grupo, um paciente teve uma resposta parcial, seis tinham doenças estáveis e onze tinham doença progressiva (20). A partir de estudos realizados em diferentes células cancerosas do pâncreas e das várias respostas obtidas no seu crescimento, parece que uma chave para o sucesso na batalha crítica contra o câncer pancreático é a expressão dos receptores específicos da somatostatina e o uso do análogo específico (37). As propriedades dos cinco subtipos clonados de receptores somatostatosin humanos e as indicações estabelecidas, prováveis e não estabelecidas para o uso de análogos de somatostatina foram resumidas na referência 77,
O uso clínico da Somatostatina
Clinicamente, octreotídeo tem sido utilizado no tratamento da pancreatite aguda, mas não houve benefício unânime confirmado. Em um estudo (111), a somatostatina foi administrada em uma dose inicial de 250 µg, seguida de 250 µg h-1 como infusão contínua; o tratamento em 9 dos 12 pacientes com pancreatite aguda reverteu a amilasemia e trouxe melhora clínica, mas não mostrou qualquer redução nas taxas de mortalidade. A somatostatina permanece, entretanto, um tratamento eficaz para complicação local estabelecida de pancreatite aguda, como fístulas pancreáticas e pseudocistos (112). Em um estudo, pacientes com tumores endócrinos metastáticos do pâncreas foram tratados inicialmente com 50 µg s.c. octreotídeo a cada 12 h e mais tarde (6-16 meses) a dose foi aumentada para 500 µg a cada 8 h. Alguns pacientes não responderam ao tratamento enquanto em outros ele foi eficaz; os sintomas melhoraram, mas eventualmente recorreram e todos os pacientes morreram uma vez atingida a fase de resistência de sua doença (163). Estes dados indicam que a somatostatina não é o tratamento ideal para a pancreatite, mas pode ser útil para tratar as complicações locais da doença. A SMS, no entanto, demonstrou ser muito eficiente na eliminação da diarréia pancreática e permitir a correção da desidratação e acidose. Seu efeito resultou na redução acentuada das concentrações plasmáticas de VIP (84).
3. Ferramentas para o estudo da somatostatina
a) Peptídeo
Somatostatina-14 e -28 estão disponíveis comercialmente. O agonista principal usado in vivo é octreotídeo (SMS 201-995) e os outros são: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 e L-362,855. Entre as séries BIM, o BIM-23056 atua como agonista no receptor SST-3, bem como antagonista no receptor SST-5 (161). As estruturas químicas destas moléculas são apresentadas na Tabela 1.
b) Anticorpos e ensaios
Anti-corpos para somatostatina -14, -28, SMS 201-995 e RC-160 foram desenvolvidos em muitos laboratórios. Como exemplos, Guillemin criou um RIA usando um anti-soro BARBAR-78; este anti-soro foi criado contra SS-14 sintético e reage cruzadamente com SS-28 de ovinos sintéticos na razão equimolar (15). Um anti-soro específico contra SS-28 também foi desenvolvido (67) e RIAs para SMS 201-995 (5) e RC-160 (83) também foram estabelecidas.
c) Modelos experimentais
A maior parte dos estudos fisiológicos realizados em humanos foram feitos em voluntários saudáveis masculinos e femininos (30). Entre os animais experimentais, os estudos foram realizados principalmente em cães conscientes com fístulas gástricas e pancreáticas (146.147), em ratos conscientes com suco biliar-pancreático desviado (25.127) e em ratos anestesiados (39). Para o efeito crônico da somatostatina no pâncreas, os ratos foram tratados diariamente com injeções de somatostatina s.c. (92). Estudos in vitro foram realizados geralmente com acini pancreático recém-preparado, lóbulos isolados ou pâncreas perfundidos isolados de rato, rato ou cobaia (65, 96.139.158). Na Tabela 2, alguns dados sobre as espécies animais utilizadas, doses ou concentrações de somatostatina e análogos dados e efeitos são apresentados.