COMMENTARY
Exclusão de corante é uma técnica simples e rápida que mede a viabilidade celular, mas está sujeita ao problema de que a viabilidade está sendo determinada indiretamente a partir da integridade da membrana celular. Assim, é possível que a viabilidade de uma célula tenha sido comprometida (medida pela capacidade de crescimento ou função) mesmo que sua integridade da membrana seja (pelo menos transitoriamente) mantida. Por outro lado, a integridade da membrana celular pode ser anormal, mas a célula pode ser capaz de se reparar e se tornar totalmente viável. Outro problema potencial é que como a absorção de corantes é avaliada subjetivamente, pequenas quantidades de absorção de corantes indicativos de lesão celular podem passar despercebidas. A este respeito, a exclusão do corante realizado com um corante fluorescente usando um microscópio de fluorescência resulta rotineiramente na pontuação de mais células não viáveis com captação de corante do que os testes realizados com azul de tripano usando um microscópio de transmissão.
Um método mais sofisticado de medir a viabilidade celular é determinar a exclusão do corante por citometria de fluxo. Isto pode ser feito usando o azul de tifão uma vez que esta proteína se liga às proteínas e então emite um sinal de fluorescência que pode ser detectado em um citômetro de fluxo (a 660 nm quando ligado à albumina de soro bovino) (Veja referência 2 para detalhes sobre o uso do azul de tripano na citometria de fluxo). Alternativamente, a exclusão pode ser medida com outros corantes emissores de luz como o iodeto de propidio (ver Unidade 5.4 para uma descrição do uso do iodeto de proprídio na avaliação da viabilidade celular através da análise citométrica de fluxo). O caparison detalhado das estimativas de células vivas vs. células mortas usando a exclusão azul de tripano avaliada manualmente como descrito aqui e avaliada eletronicamente pela citometria de fluxo indica que as duas técnicas fornecem resultados muito similares em mãos experientes. Enquanto a técnica de exclusão de corante descrita é mais susceptível de conduzir a erro devido à subjectividade do operador, a abordagem citométrica de fluxo é menos adequada para a avaliação da viabilidade celular durante a realização de técnicas complexas e demoradas de purificação celular. Assim, uma técnica citométrica de fluxo só é aplicável quando devem ser obtidas medições precisas do número de células mortas em uma mistura celular.
Recentemente, foi relatado um “teste automático de viabilidade de microscópio de fluorescência” no qual a viabilidade celular usando iodeto de propidio em conjunto com um dispositivo que conta células vivas e mortas em um contador de células de microscópio portátil equipado com um microchip. Diz-se que este contador é capaz de avaliar a viabilidade celular mais rapidamente do que a técnica manual aqui descrita ou o citómetro de fluxo e de obter contagens mais precisas e fiáveis. Este dispositivo pode ser útil em situações onde muitos ensaios de viabilidade celular adquiridos rapidamente são necessários (3).
De notar que a viabilidade celular também pode ser avaliada com corantes que se ligam ao DNA (monoazida de etídeo), agentes que se ligam à fosfatidilserina (Annexin V) e corantes reativos à amina. O uso desses agentes alternativos geralmente requer citometria de fluxo e, portanto, só é aplicável sob condições particulares.
Exclusão do azul-tripano, como descrito no protocolo acima, pode ser realizada em 5 a 10 min.