Apresentação do caso
O presente relato de caso é derivado de uma visita veterinária de rotina a uma fazenda de 155 animais, com duas raças ovinas (Pelifolk e Blackbelly), localizada em Tesistán, município de Zapopan, estado de Jalisco, México. As instalações desta fazenda foram adaptadas da fazenda anterior, e ainda estão cercadas por fazendas de porcos e bovinos na vizinhança próxima. O rebanho foi mantido em pisos elevados para facilitar a limpeza e manuseio, porém muitos objetos afiados assados (como arame, cercas quebradas, pregos, etc.) estavam presentes nos currais e a limpeza não estava sendo realizada corretamente na fazenda no momento da inspeção. A alimentação era baseada em rações disponíveis localmente, tais como: alimentos grosseiros de baixa qualidade, silagem de estrume de suínos e concentrado de alimentos comerciais com alto teor de proteínas. Esta fazenda chamou os serviços veterinários devido aos frequentes abcessos cutâneos encontrados nos animais, não foram relatadas outras queixas relacionadas com problemas de pele. Os abcessos não parecem afetar a produtividade dos animais, entretanto a presença de tais lesões afeta negativamente a comercialização dos animais e, portanto, o proprietário estava interessado em descobrir o agente etiológico e o tratamento recomendado para eliminar a doença da fazenda. O conteúdo dos abcessos foi amostrado em 31 animais (29 ovelhas, 1 carneiro e 1 cordeiro) por um veterinário certificado e enviado ao laboratório para diagnóstico bacteriológico, a fim de encontrar os agentes etiológicos que estavam causando o problema. Com base no aparecimento dos abcessos, o diagnóstico presuntivo de infecção na fazenda foi linfadenite caseosa para a maioria dos animais. Entretanto, a análise bacteriológica demonstrou que 13 animais estavam infectados com C. pseudotuberculose, 1 com Corynebacterium spp., 2 com Proteus spp., 2 com Streptococcus spp., e nos 13 casos restantes o patógeno não pôde ser identificado. A categorização para o Corynebacterium spp. isolado não foi clara porque os resultados dos testes bacteriológicos e bioquímicos não foram conclusivos.
Este trabalho descreve o isolamento da C. xerosis de um cordeiro Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) de 4 meses de idade em boas condições corporais. Tanto quanto sabemos, este é o primeiro relatório de C. xerosis produzindo um abcesso cutâneo clínico em ovelhas. Foi obtido o consentimento informado do proprietário do animal para a publicação dos resultados do estudo clínico, incluindo o material fotográfico. O animal apresentou um abcesso de consistência dura, sem drenagem, no lado esquerdo do pescoço (Fig. 1a). O diagnóstico clínico inicial sugeriu linfadenite caseosa, possivelmente causada por C.pseudotuberculose. Uma amostra para análise bacteriológica foi obtida através da punção do abscesso com uma seringa estéril de 5 ml, com uma agulha hipodérmica calibre 20, após limpeza e desinfecção da superfície do abscesso. O tipo de exsudado recuperado era seroso e de aspecto branco. A amostra biológica foi mantida a 4 °C até a caracterização biológica no Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 da estrada Toluca-Atlacomulco, Toluca, México, z.c. 50200). O tempo entre a amostragem e o processamento não excedeu 72 h. A amostra foi cultivada em duplicado, em 8% de ágar sangue de ovelha e incubada 24-48 h a 37 °C em condições aeróbias e microaerófilas . Foram observadas colônias de 1,0 mm de diâmetro, não hemolíticas, de cor marrom-amarelada e de aspecto ligeiramente seco (Fig. 2a). Essas características morfológicas não correspondiam às descritas anteriormente para C. pseudotuberculose, mas pareciam colônias de C. xerosis . Microscopicamente (ampliação de 10x; Fig. 2c) foram observadas bactérias em forma de taco, pleomórficas, com coloração irregular das hastes Gram-positivas. Os testes bioquímicos mostraram os seguintes resultados: Triplo açúcar Ferro (TSI,-), Lisina Ferro ágar (LIA,-), Citrato (CIT,-), Sulfeto Indole-Motilidade (SIM,-), Motilidade, Indole, Ornitina (MIO,-), Oxidativo-fermentativo (OF,-) Vermelho de metilo (-), Água Peptona (-), Voger Pascaguer (-), Uréia (-), Caldo Nitrato (+), Trealose (+), Sacarose (+), Maltose (+) e Fermentação de Glicose (positiva a 37 °C e negativa a 42 °C). Estes resultados poderiam corresponder a um perfil de C. pseudotuberculose, com excepção do teste da ureia, que foi negativo em vez de positivo e, portanto, melhor coincidente com um perfil de C. xerosis. Os resultados diagnósticos não foram conclusivos, portanto, mesmo que o sistema API não seja específico para identificar a C. xerosis , decidimos estudar o isolado com este sistema, para ver se este isolado poderia ser identificado como outras espécies de Corynebacterium. Além disso, a fim de descobrir se este isolado pertence a outras espécies como C. freneyi e C. amycolatum que raramente podem ser encontradas em ovelhas, testamos se a colônia era capaz de crescer a 20 °C e se era capaz de fermentar glicose a 42 °C. O isolado cresceu fino a 20 °C e não fermentou glicose a 42 °C, ambas características associadas à C. xerosis e C. hansenii , portanto decidimos realizar uma análise molecular para descobrir se poderíamos identificar molecularmente o isolado como C. xerosis. Analisamos três loci para aumentar a nossa precisão diagnóstica. Testamos para um gene normalmente ausente na C. xerosis mas presente na C. pseudotuberculose, o gene pld onde esperávamos não encontrar nenhum amplicon após o teste PCR se o isolado fosse C. xerosis em oposição a C. pseudotuberculose que amplificará uma banda de 203 bp; um segundo locus visou a amplificação da região do espaçador intergênico dos genes 16S-23S rRNA (16S-23S) usando primers projetados para C. pseudotuberculose, que foram relatados não funcionar para C. xerosis , e nós também esperaríamos nenhuma banda de amplificação para C. xerosis e uma banda de 816 bp para C. pseudotuberculose. Finalmente realizamos amplificação PCR e seqüenciamento do gene rpoB (446 bp), o qual foi relatado anteriormente para diferenciar espécies de Corynebacterium . A extração de DNA foi realizada utilizando um kit comercial (KAPA Express Extract) seguindo o protocolo do fabricante. Uma técnica Multiplex-PCR para amplificação de sequências parciais dos genes pld, 16S-23S e rpoB foi realizada usando o protocolo publicado por Pacheco em 2007 . As reações foram realizadas usando um kit de PCR multiplex comercial (QIAGEN Multiplex PCR) seguindo as especificações do fabricante. A análise PCR incluiu as seguintes amostras: O isolado a ser caracterizado, o putativamente isolado C. xerosis, e dois C. pseudotuberculose (um isolado local previamente caracterizado como biovar ovis e, uma estirpe de referência, ATCC 43924, biovar equi) usado como controle. Como esperado para a xerose C. putativa, uma única banda amplicon PCR 446 bp, correspondente ao fragmento de gene rpoB, foi amplificada, e os fragmentos de genes intergénicos 16S-23S e pld não foram amplificados. Também como esperado, ambas as cepas de C. pseudotuberculose mostraram três bandas de 203, 446 e 816 bp, correspondentes aos genes pld, rpoB e 16S, respectivamente (Fig. 3). Os amplicons do gene RpoB de todas as três amostras foram purificados usando o kit de purificação Promega (Wizard® SV Gel e PCR Clean-Up System) e enviados para sequenciamento automático por Macrogen (Rockville, MD, EUA). Os alinhamentos de sequências múltiplas obtidos a partir de um BLAST (NCBI) foram analisados juntamente com as nossas sequências isoladas utilizando a análise Clustal W do Mega 6.0.6 (Fig. 4). A análise filogenética foi realizada utilizando o método de união de vizinhos (software MEGA 6.0.6). Os valores de Bootstrap foram obtidos gerando 1000 árvores aleatórias. A análise filogenética também incluiu as sequências do gene rpoB de C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculose biovar ovis (GenBank CP002924.1) e C. pseudotuberculose biovar equi (GenBank CP003540.2). Foi possível observar diferentes grupos filogenéticos que correspondiam a espécies particulares de Corynebacterium. Estes resultados, confirmam que o isolado deste estudo (rpoB C53) é C. xerosis (Fig. 4).
Studied abscess. Um abscesso de consistência dura sem drenagem foi relatado na região do pescoço de um cordeiro de 4 meses de idade
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Cultura bacteriológica in-vitro de Corynebacterium xerosis e Corynebacterium pseudotuberculosis. As bactérias foram cultivadas em 8% de ágar sangue de ovelha. aCorynebacterium pseudotuberculose (ATCC 43924) mostrou colônias esbranquiçadas com hemólise beta. bCorynebacterium xerosis isolate, cresceu como pequenas colônias marrom-amareladas sem hemólise. c Preparação de esfregaço de Corynebacterium xerosis com coloração de Gram-positivo característico, com extremidades tipo clube
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Multiplex PCR. Amplificação de sequências parciais dos genes 16S rRNA, rpoB e pld. Pista MW: marcador de peso molecular de ADN 1 Kb Plus Ladder™ (Invitrogen). Pista 1: controlo negativo (reacção sem ADN modelo). Pista 2: pseudotuberculose de Corynebacterium biovar equi. Pistas 3-4: Corynebacterium xerosis isolate (10-0.001 ng de ADN, respectivamente). Pista 5: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Análise bioinformática. a Mostra o alinhamento de sequências a partir das sequências utilizadas para construir a árvore filogenética em (b). Três seqüências foram baixadas do GenBank: C. pseudotuberculose biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculose biovar equi (CP003540.2), e Corynebacterium xerosis (AY492233.1). Os outros três foram espécimes enviados para sequenciamento (Macrogen, Rockville, MD, EUA): rpoB13 (isolado local caracterizado como C. pseudotuberculose, biovar ovis), rpoB C1 (C. pseudotuberculose, biovar equi, cepa de referência ATCC43924) e rpoB C53 (isolado local, caracterizado como C. xerosis). b A árvore mostra a relação genética da pseudotuberculose de Corynebacterium e da xerosis de Corynebcaterium para o gene rpoB. A árvore foi construída a partir do alinhamento da sequência parcial do gene. Foram obtidos valores de Bootstrap gerando 1000 árvores aleatórias, e a força de cada ramo é indicada no respectivo nó
Técnicas de genotipagem como a PCR, assim como a análise da sequência do isolado rpoB C53 neste estudo contribuiu muito para uma correta identificação da espécie, o que foi originalmente enganoso quando se utilizaram características microscópicas e bioquímicas fenotípicas. A xerose de Corynebacterium foi previamente relatada em amostras clínicas de casos humanos em lesões em endocardite, pneumonite, osteomielite e infecções cutâneas, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Também tem sido encontrada em amostras clínicas de animais, por exemplo, em lesões hepáticas de caprinos (suspeita de pseudotuberculose), e leite de vaca, de animais que apresentam mastite. Em suínos, a C. xerosis tem sido isolada de lesões em diferentes tecidos como fígado, rim, pulmão, baço, articulações, assim como de abscesso subcutâneo. Além disso, a C. xerosis foi isolada de amostras clínicas de útero de ovinos, em caso de aborto, e de tecido pulmonar, de animais que apresentavam problemas respiratórios. Estes isolados foram identificados e caracterizados pela amplificação do gene rRNA 16S-23S usando PCR-RFLP. Entretanto, nesses estudos, não foi possível obter um padrão de banda suficientemente claro para diferenciar a C. xerosis de outras espécies de Corynebacterium. Os autores também conduziram uma análise e comparação de sequência dos genes 16S e rpoB, o que lhes permitiu diferenciar a C. xerosis de outras espécies, geneticamente semelhantes à Corynebacterium .
Como mencionado acima, este estudo foi conduzido com base na presença do gene rpoB, que tem sido relatado por outros autores como o gene de escolha para análise filogenética do gênero Corynebacterium, uma vez que apresenta alto polimorfismo, ainda maior do que a região do espaçador intergênico dos genes 16S-23S rRNA . Sabe-se que os abcessos cutâneos nos ovinos (linfadenite caseosa) são causados pela C. pseudotuberculose e seu principal fator de virulência e patogenicidade é a exotoxina fosfolipase D, codificada pelo gene pld e expressa na membrana celular da bactéria . Esta exotoxina é um fator de permeabilidade que promove a hidrólise das ligações ésteres na esfingomielina nas membranas celulares dos mamíferos, possivelmente contribuindo para a propagação das bactérias do local inicial da infecção para locais secundários através do sistema linfático para os gânglios regionais, e parece estar envolvida na redução da viabilidade dos macrófagos após a infecção . A exotoxina também causa lesões dermonecróticas . No entanto, esta exotoxina não foi relatada na C. xerosis como uma toxina patogénica que poderia contribuir para o desenvolvimento de abcessos. Isto destaca a importância de realizar mais pesquisas sobre os mecanismos de infecção presentes nesta espécie de Corynebacterium.
Um ponto importante de discussão de natureza epidemiológica, inclui o fato de que o sistema de produção ovina, de onde a amostra foi obtida, foi anteriormente utilizado para suínos, uma espécie onde a C. xerosis tem sido relatada como um patógeno comum . Além disso, um dos principais ingredientes da dieta ovina inclui subprodutos de suínos (estrume de suínos), que poderiam eventualmente ter patógenos ativos, talvez incluindo Corynebacterium spp. Além disso, objetos pontiagudos como varas metálicas, pregos e arames, estão espalhados por todas as instalações, o que aumenta a chance de lesão dos animais, abrindo uma forma de entrada de Corynebacterium spp. no organismo, incluindo a C. xerosis. Todos estes factores podem ter contribuído para a presença de C. xerosis no interior das instalações. Não foram realizados mais estudos, no entanto, as recomendações para o proprietário foram de detratar e desinfectar abcessos de todos os animais, numa área contendo infecção (para evitar a propagação dos agentes patogénicos), reforçar a limpeza dos currais e remover todas as arestas vivas e objectos das vedações, comedouros e pavimentos. Como a C. xerosis, assim como a C. pseudotuberculose, são microrganismos potencialmente zoonóticos, foram feitas recomendações ao criador para precauções extremas durante o manuseio dos animais e resíduos produzidos pela fazenda para prevenir infecções humanas e animais e a possível propagação do microrganismo para outras fazendas.