Uma abordagem para prevenir DPs consiste na optimização físico-química do sistema PCR, ou seja, alterar as concentrações de primers, cloreto de magnésio, nucleótidos, força iónica e temperatura da reacção. Este método é um pouco limitado pelas características físico-químicas que também determinam a eficiência da amplificação da sequência alvo na PCR. Portanto, a redução da formação de PDs pode também resultar numa eficiência reduzida da PCR. Para ultrapassar esta limitação, outros métodos visam reduzir a formação de PDs apenas, incluindo o desenho de primers, e o uso de diferentes sistemas ou reagentes de enzimas PCR.
Software de desenho de primersEdit
Software de desenho de primers usa algoritmos que verificam o potencial da formação da estrutura secundária do ADN e o recozimento dos primers para si mesmo ou dentro dos pares de primers. Os parâmetros físicos que são levados em conta pelo software são a potencial auto-complementaridade e conteúdo de GC dos primers; temperaturas de fusão semelhantes dos primers; e ausência de estruturas secundárias, como os laços de hastes, na sequência alvo do DNA.
PCREdit de arranque a quente
Porque os primers são desenhados para terem baixa complementaridade entre si, podem recozer (passo I na figura) apenas a baixa temperatura, por exemplo a temperatura ambiente, como durante a preparação da mistura de reacção. Embora as polimerases de ADN utilizadas na PCR sejam mais activas a cerca de 70 °C, têm alguma actividade polimerizadora também a temperaturas mais baixas, o que pode causar a síntese de ADN dos iniciadores após o recozimento uns com os outros. Vários métodos foram desenvolvidos para prevenir a formação de PDs até a reacção atingir a temperatura de trabalho (60-70 °C), e estes incluem a inibição inicial da DNA polimerase, ou separação física da reacção dos componentes da reacção até a mistura de reacção atingir as temperaturas mais elevadas. Estes métodos são referidos como PCR de arranque a quente.
Cera: neste método a enzima é separada espacialmente da mistura de reacção por cera que derrete quando a reacção atinge uma temperatura elevada.
Liberação lenta do magnésio: A DNA polimerase requer íons de magnésio para a atividade, então o magnésio é quimicamente separado da reação por ligação a um composto químico, e é liberado na solução somente a alta temperatura
Ligação não covalente do inibidor: neste método um peptídeo, anticorpo ou aptamer são ligados nãoovalentemente à enzima a baixa temperatura e inibem sua atividade. Após uma incubação de 1-5 minutos a 95 °C, o inibidor é liberado e a reação começa.
Taq polimerase sensível ao frio: é uma polimerase de DNA modificada com quase nenhuma atividade a baixa temperatura.
Modificação química: neste método uma pequena molécula é ligada covalentemente à cadeia lateral de um aminoácido no local ativo da DNA polimerase. A pequena molécula é libertada da enzima através da incubação da mistura de reacção durante 10-15 minutos a 95 °C. Uma vez a pequena molécula libertada, a enzima é activada.
Modificações estruturais dos iniciadoresEditar
Outra abordagem para prevenir ou reduzir a formação de PD é modificar os iniciadores de modo a que o recozimento entre si ou entre si não cause extensão.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): uma cauda de nucleótido, complementar à extremidade de 3′ do iniciador é adicionada à extremidade de 5′ do iniciador. Devido à proximidade da cauda de 5′ recolete com a extremidade de 3′ do iniciador. O resultado é um primer de ciclo de haste que exclui o recozimento envolvendo sobreposições mais curtas, mas permite o recozimento do primer à sua sequência totalmente complementar no alvo.
Primers quiméricos: algumas bases de DNA no primer são substituídas por bases de RNA, criando uma sequência quimérica. A temperatura de fusão de uma sequência quimérica com outra sequência quimérica é inferior à de uma sequência quimérica com ADN. Esta diferença permite definir a temperatura de recozimento de forma a que o primário se recole à sua sequência alvo, mas não a outros primários quiméricos.
Primários com bloqueio: um método conhecido como PCR dependente de RNase H (rhPCR), utiliza um RNase HII termoestável para remover um grupo de bloqueio dos primários PCR a alta temperatura. Esta enzima RNase HII não exibe quase nenhuma atividade a baixa temperatura, fazendo com que a remoção do bloco ocorra apenas a alta temperatura. A enzima também possui um primer inerente: discriminação do desajuste do modelo, resultando numa selecção adicional contra os primers-dimers.
Prevenir a aquisição do sinal dos primers-dímerosEditar
Embora os métodos acima sejam concebidos para reduzir a formação de DP, outra abordagem visa minimizar o sinal gerado a partir de DPs em PCR quantitativa. Esta abordagem é útil desde que existam poucos PDs formados e o seu efeito inibitório na acumulação do produto seja menor.
4 passos PCR: utilizado quando se trabalha com corantes não específicos, tais como SYBR Green I. É baseado no comprimento diferente, e portanto, temperatura de fusão diferente dos PDs e da sequência alvo. Neste método o sinal é adquirido abaixo da temperatura de fusão da sequência alvo, mas acima da temperatura de fusão dos PDs.
Sondas específicas da sequência alvo: TaqMan e sondas moleculares geram sinal apenas na presença da sua sequência alvo (complementar), e esta especificidade melhorada impede a aquisição do sinal (mas não possíveis efeitos inibidores no acúmulo de produtos) dos PDs.