Abstract
Aerococcus urinae é um recém-chegado na prática clínica e microbiológica, causando infecções do trato urinário, bacteraemia/septicemia e/ou endocardite. Este estudo apresenta pela primeira vez uma avaliação da atividade de um painel representativo de antibióticos contra um grande número de isolados de A. urinae. As susceptibilidades in vitro (MICs) de 56 isolados de A. urinae a 14 antibióticos foram determinadas por diluição em ágar. Em geral, os isolados de A. urinae mostraram pouca variabilidade inter-isolado, e tinham baixas MICs de penicilina, amoxicilina, piperacilina, cefepime, vancomicina e rifampicina. Não foi encontrada resistência a aminoglicosídeos de alto nível para nenhum dos isolados. Foi observada uma actividade moderada a boa com quinolonas, eritromicina e tetraciclina. Isolados de dois pacientes com endocardite foram estudados com curvas de tempo para penicilina, gentamicina e vancomicina. A penicilina e a vancomicina sozinhas exibiram lenta ou nenhuma atividade bactericida contra as duas cepas. Ao combinar penicilina ou vancomicina com gentamicina, a atividade bactericida rápida foi obtida para ambas as cepas com ambas as combinações. As opções de tratamento para A. urinae parecem incluir penicilinas para casos menos graves. Em casos graves, ou seja, endocardite, as investigações de tempo de matança sugerem um efeito benéfico da combinação com a gentamicina. Na penicilina, a vancomicina em combinação com a gentamicina representa a alternativa mais óbvia.
Introdução
Durante a última década a relevância clínica de vários catalisa-negativos, os cocos Gram-positivos têm recebido muita atenção.1 Entre estes, Aerococcus urinae é um recém-chegado na prática clínica e microbiológica, reportado pela primeira vez em 19892 e designado em 1992.3A. Os isolados de urina foram originalmente reconhecidos por sua morfologia celular (semelhante ao Staphylococcus na coloração de Gram) e características de crescimento (semelhante ao α- estreptococos hemolíticos em ágar sangue), uma reação catalase negativa e um antibiograma muito constante demonstrando susceptibilidade à penicilina e resistência às sulfonamidas e aminoglicosídeos.2-4 Em dois relatos A. cepas de urina foram isoladas de 0,4-0,8% das amostras de urina examinadas.2,5 A maioria dos pacientes dos quais A. urinae foi isolada eram idosos com condições predisponentes e sinais de infecção do trato urinário.2,4,5 Estirpes que causam infecções do trato urinário foram reconhecidas na Dinamarca, Suécia, Holanda, França, EUA, Canadá e países da América do Sul.6A. urinae também foi isolada de sangue de pacientes que sofrem de bacteremia/septicemia urogênica com ou sem endocardite.7-11 Uma pesquisa nacional na Dinamarca de 1987 a 1995 identificou 26 pacientes com A. urinae isolados do sangue,6 correspondendo a 0,5 pacientes/ano/1 milhão de habitantes, e 0,8% dos episódios de endocardite infecciosa.8 Episódios bacterémicos/septicêmicos responderam bem ao tratamento com β-lactams sozinho ou em combinação com um lado aminoglicótico, a menos que a bacteremia fosse complicada com endocardite, casos em que cinco de seis pacientes morreram. Em um paciente A. urinae poderia, na autópsia, crescer das válvulas, apesar do tratamento antibiótico aparentemente relevante. Portanto, o tratamento ideal da endocardite com A. urinae tem que ser determinado.
Teste de A. urinae isolados por métodos de difusão em comprimidos/disco revelou susceptibilidade a uma ampla gama de agentes antimicrobianos, incluindo tanto β-lactam como antibióticos não β-lactam.5,6,12 Como os isolados de A. urina têm sido associados principalmente a infecções do trato urinário, é notável que as cepas foram encontradas resistentes a sulfonamidas e outros antimicrobianos usados para tratar infecções do trato urinário, incluindo co-trimoxazol, trimetoprim, ácido nalidíxico e polimixinas.2,5,6,12 Recentemente, a susceptibilidade de dois isolados de A. urinae de pacientes com endocardite tem sido investigada por MICs de sete antibióticos, e foram realizadas curvas de tempo para matar penicilina em combinação com gentamicina ou netilmicina.11 O presente estudo caracteriza ainda mais o padrão de susceptibilidade de 56 isolados de A. urinae de várias origens geográficas. Foram determinados MICs de 14 antibióticos, e para dois isolados foram realizados experimentos com curva tempo-abate com penicilina, gentamicina e vancomicina, isoladamente ou em combinação, a fim de obter mais informações sobre os regimes ótimos de tratamento de infecções graves causadas por A. urinae.
Materiais e métodos
Estrenoses
Cinco-seis isolados clínicos epidemiologicamente não relacionados de A. urinae. urinae foram estudados, compreendendo 42 isolados dinamarqueses (17 isolados de sangue e 25 isolados de urina) e 14 isolados de urina não dinamarquesa: um da Holanda (gentilmente cedido por P. J. G. M. Rietra), quatro da Suécia (gentilmente cedido por E. Falsen, Culture Collection, Universidade de Göteborg) e sete isolados norte-americanos (gentilmente cedido por R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, EUA). Foram utilizadas as seguintes estirpes de referência: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 e Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Antimicrobianos
Os seguintes agentes antimicrobianos foram utilizados: benzilpenicilina (Leo, Ballerup, Dinamarca); cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, EUA); amoxicilina, ceftriaxona, eritromicina, amikacina, gentamicina, netilmicina, rifampicina, vancomicina (Sigma, St Louis, MO, EUA); oxitetraciclina (Rosco, Taastrup, Dinamarca), piperacilina (Lederle, Pearl River, NY, EUA), ciprofloxacina (Bayer, Leverkusen, Alemanha); e sparfloxacina (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, França).
Determinação da MIC
Devido ao crescimento fastidioso de A. urinae as condições de teste tiveram que ser modificadas a partir das recomendações padrão para realizar as determinações da MIC (ou seja, 5% de suplementação sanguínea do ágar e incubação em atmosfera de 5% de CO2 durante 48 h).13-15 As MICs foram determinadas pelo método de diluição do ágar. Foram preparadas diluições em série de duas vezes de agentes antimicrobianos em ágar Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Alemanha) suplementadas com sangue de cavalo lisado a 5%. Os antibióticos foram testados de 0,008 a 512 mg/L, excepto amoxicilina (0,032-256 mg/L), rifampicina (0,008-32 mg/L) e oxitetraciclina (0,008-2 mg/L). Os inóculos de 107 ufc/ml (104 ufc/ml) foram preparados a partir de culturas de ágar durante a noite e suspensos em NaCl 0,9%, e foram aplicados com um inoculador múltiplo de 21 pontos (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, Reino Unido). Os resultados foram lidos após incubação por 2 dias a 37°C em 5% de CO2. O MIC foi lido como a menor concentração mostrando crescimento de um máximo de três colônias.
Estudo da curva tempo-morte
Dois isolados de sangue testados (B1 e B8), ambos de pacientes com endocardite, foram investigados. As cepas foram testadas contra penicilina (MIC 0,125 e 0,6 mg/L, respectivamente), gentamicina (MIC 256 e 64 mg/L, respectivamente), e vancomicina (MIC 0.5 e 1 mg/L, respectivamente) nas seguintes concentrações clinicamente obteníveis: penicilina 2 × e 10 × MIC (P2 e P10, respectivamente); vancomicina 4 × e 10 × MIC (V4 e V10, respectivamente); gentamicina 10 mg/L (G10); e as combinações penicilina + gentamicina e vancomicina + gentamicina nas seguintes concentrações: P2G10, P10G10, V4G10 e V10G10, respectivamente. Em t = -1 h de colônias frescas de crescimento noturno foram suspensas a c. 105 cfu/mL em tubos com caldo de Todd-Hewitt pré-aquecido. Os tubos foram colocados em banho-maria a 37°C. A t = 0 h de antibióticos, preparados imediatamente antes do ensaio, foram adicionados aos tubos em duplicado. Três tubos sem antibióticos foram usados como controle de crescimento. As amostras em duplicado foram colhidas a 0, 3, 6 e 24 h de cada tubo. As amostras foram diluídas em série e laminadas. Os números de colónias sobreviventes foram contados após a incubação nocturna a 37ºC em sacos de plástico juntamente com papel tissue húmido . Usando 20 amostras μL o número mínimo de bactérias contabilizáveis foi de 50 ufc/mL. O efeito de transporte foi eliminado para as experiências de penicilina-gentamicina adicionando 100 μL 100 000 U/mL de penicilinase a cada placa. Para as experiências com vancomicina-gentamicina, o efeito de transporte foi eliminado por diluição. Uma investigação piloto demonstrou efeito de carry-over na amostra 100 mas não na amostra 10-1, portanto a ufc foi contada usando 200 μL das amostras 10-1 ainda dando um limite de detecção de 50 ufc/mL. Todos os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes em dias separados. A atividade bactericida foi definida como uma redução do inóculo em pelo menos 99,9% dentro de 24 h. Sinergia (S), efeito aditivo (A) e antagonismo foram definidos como: >2 log more kill (S), >1 e <2 log more kill (A) e >2 log decreased killing, respectivamente, para a combinação em comparação com o melhor dos antibióticos individuais.
Resultados
Determinação do MIC
Os MICs obtidos para os 56 isolados são mostrados na Tabela. Usando os pontos de ruptura para estreptococos recomendados pelo NCCLS14,15 ou pelo Grupo de Referência Sueco de Antibióticos (SRGA),16,17 os isolados foram suscetíveis às penicilinas, enquanto que a susceptibilidade às cefalosporinas testadas foi reduzida. Os MICs para os aminoglicosídeos indicaram susceptibilidade reduzida para quase todos os isolados. Entretanto, não foi encontrada resistência de alto nível aos aminoglicosídeos (ou seja, gentamicina > 1000 mg/L) para nenhum dos isolados. Todos os isolados eram suscetíveis à vancomicina. Rifampicina foi a droga mais ativa testada com uma MIC50 de 0,031 mg/L (intervalo <0,004-0,064 mg/L), exceto para um isolado com uma MIC > 32 mg/L (testes repetidos). As atividades das quinolonas ciprofloxacina e sparfloxacina foram igualmente boas.
Exames da curva de matança
Curvas médias de tempo de matança para cada experimento são apresentadas na Figura. Somente a vancomicina (tanto 4 × como 10 × MIC) exibiu atividade bactericida contra a estirpe B1. Para a penicilina, a atividade bactericida foi encontrada apenas para 10 × MIC contra a B8. Para ambos os antibióticos o efeito bactericida foi lento, ou seja, a Gentamicina não era bactericida – na maioria das experiências foi observado crescimento. A penicilina em combinação com a gentamicina era sinérgica e era rapidamente bactericida para a estirpe B8 tanto na P2G10 como na P10G10. Para a estirpe B1, no entanto, apenas foi encontrado um efeito bactericida aditivo e lento. Ao combinar vancomicina com gentamicina, foi encontrado um rápido efeito bactericida para ambas as estirpes. Um efeito sinérgico foi detectável após 3 h e 6 h para a estirpe B8. Às 24 h, porém, a atividade de matança da vancomicina foi tão pronunciada que não foi possível detectar um efeito sinérgico. Para a B1 apenas foi encontrado efeito aditivo. Não foram registrados efeitos antagônicos em nenhum dos experimentos.
Discussão
Este estudo apresenta pela primeira vez uma avaliação das MICs de um painel representativo de antibióticos contra um grande número de isolados de A. urinae obtidos de pacientes com infecção do trato urinário, bacteremia/septicemia e/ou endocardite. Para avaliar o uso de antibiogramas para fins taxonômicos, MICs de 15 antibióticos para 10 cepas de A. urinae foram examinadas anteriormente,12 mas dados detalhados não foram apresentados.
A. urinae são organismos fastidiosos que requerem suplementação de sangue na mídia e às vezes incubação em uma atmosfera enriquecida com CO2 e/ou um período prolongado de incubação para obter crescimento suficiente para testar a suscetibilidade aos antibióticos. Portanto, as cepas não puderam ser testadas usando condições padrão como descritas pelo BSAC ou NCCLS.13-15 A necessidade de modificar as condições de cultura é, entretanto, um problema comum para bactérias Grampositivas fastidiosas.18,19A. urinae isolados apresentaram um padrão de susceptibilidade antimicrobiana similar ao do α- estreptococos hemolíticos com apenas pequenas variações de susceptibilidade inter-isolado. As MICs de β-lactams para os isolados foram tipicamente dentro de quatro etapas de diluição dupla, exceto para as cefalosporinas ceftriaxona e cefepime, que mostraram uma maior variação na MIC (Tabela). Devido à possível influência da incubação de CO2 (diminuição do pH), deve-se ter cuidado ao julgar a suscetibilidade à tetraciclina (suscetibilidade superestimada) e à eritromicina (suscetibilidade subestimada). Entre os A. urinae isolados examinados, não foi identificada resistência de alto nível contra os aminoglicosídeos testados, deixando em aberto a possibilidade de um efeito sinérgico quando combinados com um β-lactam ou vancomicina (vide infra). Como julgado pelos MICs, existem várias alternativas de tratamento para infecções graves, já que os isolados eram suscetíveis a penicilinas, vancomicina e rifampicina (exceto um isolado). As quinolonas selecionadas, ciprofloxacina e sparfloxacina, também mostraram boa atividade. Embora seja um organismo fastidioso, os resultados obtidos pelos métodos de difusão em disco2,5,20 têm sido de acordo com os MICs apresentados neste estudo, sugerindo que um resultado confiável pode ser obtido usando esses métodos de suscetibilidade de rotina.
Guia para o tratamento de infecções graves, como septicemia com ou sem endocardite, deve ser baseada na experiência clínica em estudos cuidadosamente desenhados, mas isso é difícil quando se lida com bactérias raras. Portanto, estudos in vitro incluindo técnicas de curva de matança podem fornecer informações importantes para o clínico nestes casos.
Concentrações antibióticas alcançáveis in vivo foram escolhidas para as experiências. Para a gentamicina foi escolhida uma dose de 10 mg/L, correspondente à concentração obtida por uma dose diária de 240 mg (equivalente a 3-4 mg/kg).21 Além disso, embora vários artigos defendam a dosagem dupla diária de endocardite, na Dinamarca é comumente utilizada uma vez por dia a gentamicina, devido à redução da nefrotoxicidade e ao fato de que o efeito sinérgico com os antibióticos de β-lactam aumenta com o aumento das concentrações de aminoglicosídeos.22 Os dados obtidos em nosso estudo in vitro de curvas de matança para penicilina e vancomicina mostraram que nem a penicilina nem a vancomicina eram bactericidas contra qualquer um dos dois isolados testados de pacientes com endocardite infecciosa. Quando combinado com gentamicina, um efeito bactericida foi obtido contra ambos os isolados tanto para a penicilina quanto para a vancomicina. Felizmente, esses regimes são recomendados para tratar endocardite infecciosa de etiologia desconhecida em todo o mundo.23 As taxas de mortalidade das duas linhagens foram diferentes, indicando que podem existir variações entre as linhagens. Apesar da susceptibilidade in vitro aos antibióticos administrados, descobrimos que o prognóstico era pobre para pacientes idosos que sofrem de endocardite infecciosa causada por A. urinae.8 Os resultados atuais para penicilina, gentamicina e netilmicina (MIC) estão de acordo com os do recente relatório suíço de Zbinden et al.11 para dois isolados de A. urinae de pacientes com endocardite.
As opções de tratamento para A. urinae parecem incluir penicilinas para casos menos graves. Em casos graves, ou seja, endocardite, as investigações sobre o tempo de matança sugerem um benefício de combinar penicilina ou vancomicina com gentamicina. No paciente alérgico à penicilina a vancomicina representa a alternativa mais óbvia.
MICs de 14 agentes antimicrobianos de A. urinae (n = 56)
O limite superior de susceptibilidade para estreptococos de acordo com o NCCLS15 ou por SRGA16,17 marcado por sombreamento cinza.
aNúmero de estirpes.
bMIC *< 0,032 mg/L.
cMIC > 32 mg/L.
dMIC > 2 mg/L
MICs de 14 agentes antimicrobianos de A. urinae (n = 56)
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O limite superior de susceptibilidade para estreptococos de acordo com o NCCLS15 ou por SRGA16,17 marcado por sombreamento cinza.
aNúmero de estirpes.
bMIC *< 0,032 mg/L.
cMIC > 32 mg/L.
dMIC > 2 mg/L
Curvas temporais de dois isolados de A. urinae (B1 e B8) (média de dois ou três experimentos). (a) Isolar B1, penicilina + gentamicina; (b) isolar B8, penicilina + gentamicina; (c) isolar B1, vancomicina + gentamicina; (d) isolar B8, vancomicina + gentamicina. As barras de erro são desvios padrão. Uma linha sólida marca o limite de detecção. Símbolos para (a) e (b): ×, P2G10; ▴, P10G10; ▾, P2; ♦, P10; -, G10; *, controlo. Símbolos para (c) e (d): ×, V4G10; ▴, V10G10; ▾, V4; ♦, V10; -, G10; *, controle.
Curvas temporais de dois isolados de A. urinae (B1 e B8) (média de dois ou três experimentos). (a) Isolar B1, penicilina + gentamicina; (b) isolar B8, penicilina + gentamicina; (c) isolar B1, vancomicina + gentamicina; (d) isolar B8, vancomicina + gentamicina. As barras de erro são desvios padrão. Uma linha sólida marca o limite de detecção. Símbolos para (a) e (b): ×, P2G10; ▴, P10G10; ▾, P2; ♦, P10; -, G10; *, controlo. Símbolos para (c) e (d): ×, V4G10; ▴, V10G10; ▾, V4; ♦, V10; -, G10; *, controle.
Endereço de correspondência. Departamento de Investigação e Desenvolvimento, Statens Serum Institut, Artillerivej 5, DK-2300 Copenhagen S, Dinamarca. Tel: +45-3268-3535; Fax: +45-3268-3873; E-mail: [email protected]
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