Sitestyrd mutagenes (SDM) är en teknik som används för att mutera en eller flera baser i en plasmid. Detta tillvägagångssätt kan ändra aminosyrasammansättningen, förstöra bindningsställen för transkriptionsfaktorer eller skapa fusionsproteiner – för att nämna några exempel.
Och även om SDM används mest för att undersöka strukturen och den biologiska aktiviteten hos nukleinsyror och proteiner, är det också användbart för att introducera eller ta bort restriktionsenzymers igenkänningsställen för att underlätta kloning.
Det är också användbart som ett verktyg för kodonoptimering för att byta ut sällsynta kodon i uttrycksvektorer för att förbättra effektiviteten i uttrycket av heterologt protein. Detta är ibland nödvändigt på grund av kodonbias, ett fenomen där organismer föredrar vissa kodoner framför andra, beroende på tillgången på tRNA i cellen. Du kan läsa mer om kodonanvändning och kodonbias här.
När SDM används för att ändra kodningssekvensen skapar SDM specifika mutantkonstruktioner som saknar kritiska rester eller proteindomäner som är involverade i posttranslationella modifieringar eller reglering av proteinets stabilitet. Att ta bort kritiska rester eller regioner i dina plasmider, t.ex. fosforyleringsställen eller kritiska domäner, är ett sätt att påvisa betydelsen av vissa proteinegenskaper. Om man t.ex. ändrar fosforyleringsställen, t.ex. serin till icke-reaktivt alanin eller till fosfomimetika som asparaginsyra, får man tillförlitliga bevis för platsspecifik proteinfosforylering. Det gör det möjligt att studera in vitro-implikationer av sådana posttranslationella modifieringar.
Traditionella metoder för platsstyrd mutagenes
Invers PCR
För deletion eller insättning av >50 bp är invers PCR den mest populära metoden. Invers PCR använder back-to-back primers för att amplifiera hela plasmidet, följt av ligering av den linjära produkten som bildar cirkulärt DNA. Denna teknik är också lämplig för större insertioner eller deletioner, t.ex. för att ta bort en regulatorisk domän från ett protein.
För deletioner kan det utvalda området avlägsnas genom att utforma primers som annealiserar på vardera sidan av den målinriktade deletionszonen. Amplifikationen fortsätter utåt från detta område, vilket utesluter denna region från PCR-produkten. När den linjära produkten är ligerad kommer din nya konstruktion att sakna denna deletionsdomän. Denna process beskrivs schematiskt i figur 1 nedan.
Figur 1. Protokoll för invers PCR i SDM.
Insertioner kan uppnås genom att använda överlappande primers med flankerande sekvenser som innehåller lämpliga extrabaser. För mer information om invers PCR, se dessa resurser:
- Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetics. 120:621-623.
- Clifford N. Dominy och David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR.
SDM Using Modified Primers
Denna teknik använder modifierade primers för att införliva små basparändringar i en plasmid och är den metod som väljs för platsspecifika mutationer. Till att börja med behöver du designa några primers. Men innan du börjar:
- Utskriv ut en kopia av en aminosyrakodontabell
- Har du din plasmid- eller proteinsekvens i beredskap.
- Säkerställ att du vet var startkodonet är och i vilken läsram din sekvens läses.
Primersdesign
Sök efter SDM-primers med en längd på cirka 30 bp med din muterade plats så nära centrum som möjligt. Även om det är acceptabelt att göra primers lite längre eller kortare efter behov, bör det finnas minst 12 bp på vardera sidan av din muterade plats.
Om du behöver hjälp med att designa primers listar http://molbiol-tools.ca/PCR.htm några riktigt användbara resurser som kan hjälpa dig på traven.
Välj rätt reagenser
Ordinärt Taq-polymeras räcker helt enkelt inte till när det gäller SDM – du måste använda ett korrekturläsningsenzym. Det finns en rad olika kommersiellt tillgängliga polymeras-satser som klarar uppgiften och som innehåller en rad funktioner, bland annat hög fidelitet (korrekturläsningsförmåga) och aktivering vid varmstart. En möjlighet är Takaras In-Fusion HD Cloning Plus – en allt-i-ett-lösning som innehåller ett polymeras med hög fidelitet, ett kit för PCR-rening, ett kloningsenzym och kompetenta celler för platsstyrd mutagenes.
Tänk på att precis som de flesta laboratoriereagenser har många polymeraser sina egna för- och nackdelar – generellt sett har laboratorier historiska skäl för att välja den ena framför den andra och avviker sällan från detta. Även om det är förnuftigt att hålla sig till det som fungerar är det ingen skada att läsa litteraturen på andra tillgängliga resurser för att se till att du har de bästa reagenserna för jobbet!
PCR-reaktion
De PCR-förhållanden som används kommer att variera beroende på ditt val av kit och polymeras, samt de primers du har designat och produktens storlek. Exemplet nedan är dock en bra utgångspunkt.
| Steg | Temp (°C) | Tid (s) | Cykler |
|---|---|---|---|
| Denatur | 94 | 15 | 18 |
| Anneal | 60 | 30 | 18 |
| Extension | 72 | 20/kb plasmid | 18 |
Tabell 1: Exempel på SDM-program för termisk cykling
Om antalet cykler är lågt förhindrar man att oönskade mutationer uppstår. Arton cykler bör ge en rimlig mängd muterad produkt utan att oönskade mutationer införlivas. Observera att antalet cykler kan ändras vid behov under felsökning.
Digest It!
Nu när du har din PCR-produkt klar, glöm inte det kritiska steget – digestion! Här digestar du föräldrarnas mall-DNA för att se till att du bara har den muterade plasmiden för bakterietransformation. Standardprotokollen kräver en 1 timmes inkubation vid 37 °C med endonukleas Dpn1 för att smälta allt dammetylerat och hemimetylerat föräldra-DNA, så att du får kvar din önskade muterade plasmid.
Transformera och sekvensera
Transformera din plasmid till kompetenta celler precis som du skulle göra med alla andra uttrycksplasmider och isolera enskilda kolonier för plasmidisolering.
Nu bör du ha en liten volym av din önskade plasmid. Innan du börjar experimentera bör du skicka ett prov för sekvensering för att bekräfta förekomsten av din önskade modifikation(er). Det är lika viktigt att se till att det inte finns några sekundära oönskade mutationer.
Om sekvenseringen återkommer med ett positivt resultat – grattis, du är ett SDM-proffs! Men om sekvenseringen ger ett negativt resultat – oroa dig inte! Du kan alltid försöka igen – våra experttips för felsökning av SDM bör få dig tillbaka på rätt spår!
Nuförtiden innebär de sjunkande kostnaderna för oligonukleotidsyntes och framstegen inom syntetisk biologi att syntetiska metoder vinner mark framför platsstyrd mutagenes. Dessutom har framväxten av CRISPR/Cas9-tekniken också förenklat genredigering så att mutagenes nu kan utföras in vitro och in vivo i några få enkla steg. Trots detta fortsätter SDM att vara en stöttepelare i den molekylärbiologiska verktygslådan och är inte på väg någonstans i närtid.
Originellt publicerat 2016. Uppdaterad och återpublicerad 2018.
Har detta hjälpt dig? Dela då gärna med dig till ditt nätverk.