Transwell-migrationsanalysen är en klassisk teknik som gör det möjligt för forskare att kvantifiera cellrörelser. Migration avser en cells förmåga att röra sig individuellt eller i kluster. Cellrörelser möjliggörs genom exakt omstrukturering av deras cytoskelett och migration sker vanligtvis som svar på stimuli som fungerar som signaler.
I dag ska vi diskutera transwell-migrationsanalysen, som använder en enkel kammaruppställning för att bedöma migration som svar på lockande signaler.
Vi börjar med att ge lite bakgrundsinformation om transwellkammaren.
Apparaten utformades först av dr Stephen Boyden 1961, som använde den för att studera leukocytmigration. Därför är denna metod också känd som Boyden-kammarassay.
I en enkel Boyden-kammare består den yttre väggen av brunnar, som de i en 96-brunnsplatta. Inuti varje brunn placeras en transwell, som är en cylindrisk insats. Insatsen har ett polykarbonatmembran med en definierad porstorlek. När den placeras i brunnen delar den kammaren i två avdelningar. I det översta facket placeras celler vars vandringsbeteende ska studeras, och i det nedre reservoaren placeras lösningen av kemoattraktionsmedel. Per definition är en kemoattraktor en molekyl som har förmågan att främja cellmotilitet genom att ”locka till sig celler”.
På grund av dessa attraktionskrafter vandrar cellerna i det övre facket genom porerna in i den nedre reservoaren. Om cellerna har adherenta egenskaper, som vissa melanomceller, kommer de efter rörelsen att ”fastna” på membranets undersida. I detta fall kan membranet fixeras, färgas och cellerna kan räknas i mikroskopet. Å andra sidan kommer icke-häftande celler, som spermier, att vandra in i bottenbehållaren. I det här fallet kan cellerna i reservoarlösningen räknas med hjälp av en hemocytometer.
Trots att upplägget för den här analysen är enkelt finns det flera saker som du måste tänka på före experimentet. Låt oss gå igenom några av dem.
För att börja med utsädeslösningen måste du se till att tätheten är optimerad för att observera cellmigrationen. För få celler kan resultera i odetekterbar migration, och större tätheter kommer att överbefolka membranet, vilket gör det svårt att räkna upp migrationen. Det andra övervägandet är insatsens porstorlek. Den bör väljas noggrant beroende på celltyp. Om porstorleken är för liten kommer cellerna inte att kunna passera igenom.
Alternativt, om porstorleken är för stor kommer cellerna bara att falla igenom, vilket inte är migration. Slutligen måste man vara uppmärksam på den kemoattraktiva koncentrationen och den inkubationstid som ska tillåtas för migration, eftersom dessa är ömsesidigt beroende av varandra. Optimal koncentration med lämplig inkubationstid under vilken koncentrationsgradienten upprätthålls mellan avdelningarna inducerar cellmigration på grund av kemoattraktion. Omvänt kan långvariga inkubationer åtföljas av en utjämning av kemoattraktionsmedel i hela kammaren, vilket leder till att den kemiska gradienten går förlorad, vilket kan förvirra analysen av de erhållna resultaten.
Med dessa överväganden i åtanke ska vi diskutera ett protokoll som används för att mäta migrationen av adherenta celler.
Celler som ska analyseras förbereds i ett proteasfritt medium, eftersom proteaser kan denaturera viktiga membranreceptorer och i slutändan påverka migrationen. När cellerna har förberetts bör suspensionen spädas ut till en optimal utsädesdensitet. För att förbereda kammaren placeras transwells i brunnar på en multiwellplatta. Cellsuspensionen ska pipetteras in i transwell utan att röra vid membranet eller föra in luftbubblor.
Khemoattraktiva lösningen pipetteras in i den nedre behållaren, varvid man ser till att lösningen rör vid insatsens membran. Inkuberingstiden för migrationen beror på de experimentella övervägandena. Efter inkubationen fixeras membranen genom att insatsen doppas i 70 % etanol. Efter att ha låtit insatsen torka tillsätts cellfärgningslösning.
Nästan inkuberas cellerna i cirka 30 minuter i rumstemperatur. Efter inkubationen tvättas insatserna med hjälp av tvättbuffert. Slutligen kan membranet skäras ut och placeras på ett mikroskopglas. Cellerna på membranets undersida representerar antalet celler som har migrerat i närvaro och frånvaro av kemoattraktiva ämnen.
När du nu har en känsla för protokollet, låt oss ta en kort titt på hur forskarna använder den här metoden i sina undersökningar.
En av de vanligaste tillämpningarna av den här analysen är att utvärdera kemoattraktiva egenskaper hos okända föreningar. Här var forskarna intresserade av att undersöka grodspermiernas simvägar i närvaro av allurin, som är ett ämne som utsöndras av amfibieägg. För att göra detta pipetterade de först aktiva grodspermier till toppen av transwellinsatserna. I botten tillsatte de allurin. Efter att ha låtit cellerna vandra räknade de spermier i reservoarlösningen i ett mikroskop. Med hjälp av denna teknik kunde de generera en koncentrationsresponskurva som visar effekten av allurinkoncentrationen på spermiernas migration.
När en cell angrips av patogener sänder den ut kemoattraktanter för att rekrytera immunceller som migrerar, fäster och därefter löser infektionen. För att testa detta fenomen odlade dessa forskare epitelceller på undersidan av insatserna. Därefter infekterade de dessa celler med olika bakteriestammar. Slutligen förde de in immunceller i den övre kammaren. Det är känt att de infekterade cellerna producerar flera kemoattraktiva ämnen som inducerar immuncellsmigration. Resultaten av detta experiment visade olika grader av neutrofil migration som svar på olika typer av bakterieinfektioner.
Sist har cancercellers invasion och metastasering genom den extracellulära matrisen alltid fascinerat cellbiologer. Här ville forskarna fastställa hur specifika kemoattraktanter kan bidra till sådan migration genom en 3D-matris. De genmodifierade två separata pooler av celler: en som uttrycker grönt fluorescerande protein och en annan som uttrycker rött fluorescerande protein. De pipetterade sedan en extracellulär matrisimitation till toppen av transwells.
När den hade stelnat, vände de transwellen och sådde två pooler av celler på membranets undersida. Därefter satte de tillbaka insatsen i multiwellplattan och pipetterade den kemoattraktiva lösningen i den övre kammaren. Detta fick cellerna i botten att röra sig uppåt och genom 3D-matrisen. Med hjälp av konfokal avbildning rekonstruerade dessa forskare cellmigrationen i 3D och skiljde på migrationsmönstren hos två grupper av celler.
Du har just tittat på JoVE:s video om transwell-migrationsanalysen. Med förståelse för komponenterna och protokollet för denna metod vet du nu varför den används så ofta av cellbiologer. Trots enkelheten i den här inställningen gör de olika konfigurationer som den här metoden kan anpassa sig till den oumbärliga för studier av cellmotilitet. Som alltid tack för att du tittade på!