Obří protein Titin

K detekci proteinových pásů v rozmezí 10 až 200 kD se běžně používají standardní proteinové gely s obsahem akrylamidu od 6 do 15 %. Protože tato metoda vylučuje detekci větších proteinů, teprve před dvěma desetiletími objevili vědci pomocí netradičních 2% gelů nový gigantický protein s extrémně nízkou zdánlivou pohyblivostí. Molekulová hmotnost tohoto nového proteinu, titinu1 (označovaného také jako connectin2 ), byla dříve odhadována v rozmezí 1,2 až 3,0 MD (přehled viz odkazy 3 a 4). Při porovnání intenzity titinových pásů na SDS gelech s intenzitou ostatních myofibrilárních proteinů se ukazuje, že titin je po myozinu a aktinu třetím nejhojnějším svalovým proteinem, který tvoří ≈10 % celkového obsahu svalových proteinů. Dospělý člověk o tělesné hmotnosti 80 kg tak může obsahovat přibližně půl kilogramu titinu. Vzhledem k jeho hojnosti je pozdní objev titinu poměrně překvapivý.

V průběhu 80. let 20. století prokázaly elektronmikroskopické studie s titin-specifickými protilátkami, že titin je nedílnou součástí myofibril. Ukázalo se, že jednotlivé molekuly titinu se rozprostírají od disku Z až po linii M, a tvoří tak vedle tlustých (většinou myozinových) a tenkých (většinou aktinových) vláken třetí sarkomerický vláknový systém.5 Podle toho bylo zjištěno, že purifikované nativní molekuly titinu vizualizované elektronovou mikroskopií jsou >1 μm dlouhé.6 Tyto molekuly se navíc jevily jako tyčinka s korálkovou substrukturou,6 protože jejich peptidové řetězce jsou složeny převážně z Ig-like a FN3-like repetic,7 které se skládají do globulárních domén a tvoří téměř 90 % hmotnosti titinu (obr. 1). V pásmu A jsou tyto repetice uspořádány do vysoce uspořádaných vzorů a pomáhají organizovat strukturu tlustého vlákna tím, že poskytují pravidelně rozmístěná vazebná místa pro další proteiny pásma A, zejména lehký meromyosin a protein C (přehled viz odkaz 15). Díky těsnému spojení s proteiny tlustého vlákna je část A-pásu titinu za fyziologických podmínek funkčně tuhá. Naproti tomu část titinového pásu I je elastická.517 Když jsou titinová vlákna extrahována ze sarkomery nebo degradována zářením či proteázami, tuhost relaxované myofibrily klesá (přehled viz odkazy 3 a 4). Nedávno se ukázalo, že titin nese většinu klidového napětí během fyziologických extenzí, a to jak v kosterním, tak srdečním svalu.1819

Přístupy na molekulární úrovni ke zkoumání úlohy titinu ve struktuře a elasticitě svalu se staly snazšími po určení sekvence cDNA lidských kosterních a srdečních titinů.8 Jak již bylo dříve naznačeno na základě rozdílné pohyblivosti kosterních a srdečních titinů na SDS-gelu,2021 je nyní jasné, že titin je v různých svalových tkáních exprimován v různých izoformách.8 Například lidský srdeční titin je kódován obrovskou 82kb mRNA, která obsahuje 81kb otevřený čtecí rámec kódující peptid o velikosti 27 000 reziduí (Mr, 2993 kD). Naproti tomu lidský soleus titin je podstatně větší polypeptid s molekulovou hmotností ≈3700 kD. Tyto rozdíly jsou výsledkem řady alternativních sestřihů titinu I. pásu v různých svalových tkáních.8

Elasticita titinu

Při natažení uvolněných vláken příčně pruhovaného svalu vzniká vtahovací síla, která se označuje jako pasivní nebo klidové napětí (tuhost). Již dlouho je známo, že srdeční sval je mnohem tužší než kosterní sval. Dříve se mělo za to, že vysoká pasivní tuhost srdeční svalové tkáně vyplývá především z nízké poddajnosti extracelulárních struktur, jako je kolagen,22 ale s příchodem preparátu s jedním myocytem23 se ukázalo, že tuhé struktury se musí nacházet alespoň částečně uvnitř buňky.2425 Tuhé extracelulární prvky, které pomáhají zabránit nadměrnému natažení svalové tkáně, se mohou nacházet pouze při extrémnějším namáhání. Nedávno se také podařilo prokázat, že při protažení uvolněných, jednotlivých, izolovaných myofibril vzniká významná pasivní síla, přičemž srdeční preparáty jsou přibližně o řád tužší než kosterní preparáty.19 Tyto rozdíly v tuhosti jsou dnes známy jako důsledek exprese různě dlouhých variant titinu specifických pro daný typ svalu, přesněji řečeno jako důsledek rozdílné exprese dvou odlišných rodin titinových motivů v pásmu I (obr. 1).813 Jeden typ motivů představují tandemově uspořádané domény Ig. Nejtužší příčně pruhovaný sval obratlovců, srdce, exprimuje 40 tandemových Ig domén, zatímco mnohem poddajnější sval soleus exprimuje 93 tandemových Ig domén. Dalším odlišně exprimovaným segmentem titinu s I-pásmem je odlišný typ motivu označovaný jako PEVK doména, protože prolinové, glutamátové, valinové a lyzinové zbytky tvoří ≈70 % jeho sekvence.8 Tato doména PEVK je také nejkratší v srdci a mnohem delší v kosterním svalu: lidská srdeční oblast PEVK obsahuje 163 zbytků, zatímco lidská podkolenní oblast PEVK má ≈2200 zbytků (obr. 1).8

Objev rozdílné exprese jak PEVK, tak tandemové-Ig oblasti titinu si vyžádal určení relativního podílu těchto dvou odlišných segmentů I-pásu na elasticitě myofibril. O takovou identifikaci jsme se nedávno pokusili sledováním polohy vybraných epitopů titinových I-pásů protilátek v natažených jednotlivých myofibrilách13 nebo svalových vláknech14 , navíc s měřením pasivní tahové odezvy vzorků (obr. 2; srovnej s odkazem 13 ). Předpokládalo se, že při volné délce sarkomery jsou domény I-pásu titinu v kompaktním stavu, zatímco malé protažení může vyvolat narovnání tandem-Ig oblastí.13142728 Toto počáteční protažení koreluje pouze s malým (srdeční sval) nebo dokonce zanedbatelným (kosterní sval) zvýšením pasivního napětí202125 , a nemusí být tedy způsobeno rozbalením tandem-Ig modulů, u nichž bylo prokázáno, že se nezávisle skládají do termodynamicky stabilních domén.9 Při středně dlouhých až dlouhých úsecích se zdá, že k hlavnímu prodloužení dochází v oblasti PEVK, alespoň u kosterních myofibril1314 , zatímco pasivní napětí se neustále zvyšuje (obr. 2). U srdečních myofibril může krátká oblast PEVK8 rovněž podporovat pasivní napětí, ale pouze v omezené míře (srovnej s legendou k obr. 2). Po vyčerpání roztažitelnosti segmentu PEVK by pasivní napětí mohlo být určeno především rozbalováním domén Ig2728 ; protože však maximální délka srdečních sarkomer nepřesahuje in vivo ≈2,4 μm, je nepravděpodobné, že by k takovému rozbalování docházelo za fyziologických podmínek.13

Závěrem lze říci, že vysoká roztažitelnost oblasti PEVK při fyziologickém množství protažení1314 naznačuje, že tato doména je schopna se rozbalit na prodloužený polypeptidový řetězec. Proto oblast PEVK titinu a tandemové domény Ig mohou tvořit systém dvou pružin působící v sérii. Tkáňově specifická exprese obou pružin v různých délkových variantách může nyní vysvětlit, proč jsou pasivní mechanické vlastnosti příčně pruhovaných svalů tak rozmanité. Exprese různých délek tandem-Ig segmentů v různých typech svalů by mohla být důležitá pro nastavení fyziologické délky ochablé sarkomery, zatímco diferenciální sestřih sekvencí bohatých na PEVK může řídit charakteristickou tuhost uvolněné svalové tkáně. Důležitým úkolem je nyní odhalit, jaká terciární struktura umožňuje oblasti PEVK titinu podstupovat masivní a rychle reverzibilní konformační změny, které zásadně určují pasivní napětí a elasticitu myofibril.

Nejnovější role titinu v biologii svalových buněk

V současné době není známo, které mechanismy přenosu buněčných signálů mohou řídit translaci, sestavení a také rozložení a obrat obřího polypeptidu titinu během myogeneze a růstu. Titin obsahuje stovky vazebných míst pro myosin, protein C a proteiny linie M715 a pravděpodobně i pro značný počet dosud neidentifikovaných proteinů Z-disku a I-pásma. Jak tedy svalová buňka řídí translaci titinového peptidu o 27 000 až 33 000 reziduích a jak může být syntéza titinu těsně spojena s montáží titinových ligandů během myogeneze? Přitažlivým modelem by bylo, že mRNA titinu, myosinu a C-proteinu jsou kolokalizovány a kotranslačně sestavovány,29 čímž nutí vznikající peptidové řetězce do proteinové sítě parakristalinového uspořádání, které se vyskytuje in vivo. Je zřejmé, že lepší pochopení toho, jak je supramolekulární sestava titinu a tlustého vlákna schopna vytvořit vysoce uspořádanou trojrozměrnou síťovinu, musí nyní přinést biochemická charakterizace exprimovaných fragmentů titinu, myosinu a C-proteinu a možná i studie metabolismu titinové mRNA.

Další mechanismus řízení sestavování titinových vláken by mohl být naznačen v některých charakteristických rysech titinové sekvence: kromě oblasti PEVK a 244 až 297 kopií strukturních opakování Ig a FN3 (v závislosti na typu svalu) obsahuje titin také 19 unikátních sekvenčních inzercí, které dohromady tvoří ≈300 kD, tedy 8 až 10 % hmotnosti titinu.8 Dvě unikátní sekvenční inzerce, umístěné v N- a C-koncové oblasti titinu, kódují tandemově uspořádané SP motivy (obr. 1). Serinové zbytky v SP repeticích mohou být in vitro fosforylovány ve svalových extraktech3031 , což by mohlo vysvětlovat, proč se titin rychle značí in vivo, když je zvířatům podán fosfát.32 Je možné, že dosud neidentifikované cesty fosforylace/defosforylace tak mohou řídit sestavování titinových vláken. V budoucnu by mělo být zajímavé prozkoumat funkční důsledky fosforylace na konci Z-disku a M-linie titinu.

Jedna z unikátních sekvenčních inzertů titinu nacházející se v blízkosti C-konce kóduje serin/treoninovou kinázovou doménu (obr. 1).7 Tato doména a organizace flankujících Ig a FN3 repetic jsou velmi podobné jako u obřích bezobratlých proteinů, twitchinu a projectinu.3334 V kinázových doménách twitchinu i titinu byla prokázána vazebná místa pro kalmodulin.3536 Nedávno bylo prokázáno, že kináza twitchinu z měkkýše Aplysia je aktivována o několik řádů prostřednictvím všudypřítomného kofaktoru S100 regulovaného vápníkem.37 Zdá se tedy pravděpodobné, že twitchin – a možná i titin – představují nový systém filament citlivých na vápník ve svalu. Navzdory rostoucím poznatkům o faktorech, které řídí aktivitu titin/twitchin kináz na umělých substrátech, zůstává skutečný substrát těchto kináz (a tedy i jejich fyziologická role) neznámý.

Pro lepší pochopení fyziologie sestavování/rozkládání titinu na molekulární úrovni by mohl být důležitým krokem objev specifických vazebných míst na titinu pro proteázu kalpain, p94,16 (srovnej s obr. 1). Na rozdíl od všudypřítomných kalpainů exprimovaných ve všech typech buněk je p94 exprimován pouze ve svalových tkáních. Pomocí p94 jako návnady pro kvasinkový dvouhybridní screen byly na titinovém vláknu identifikovány dva odlišné lokusy vázající p94.16 První místo se nachází v centrální oblasti I-pásu titinu. Je možné, že štěpení titinu v tomto místě proteázami regulovanými p94 nebo p94 může vysvětlovat, proč se titin snadno rozkládá na tzv. titin T2 (nebo beta-konektin).3 T2 by pak mohl být fyziologickým produktem rozkladu titinu, který se podílí na obratu myofibril. Kromě toho se druhé vazebné místo na titinu pro p94 nachází na C-konci vlákna, což se shoduje s posledním unikátním sekvenčním insertem titinu (obr. 1). Ačkoli není jasné, proč jsou na titinu přítomna nejméně dvě odlišná vazebná místa pro p94, je možné, že – vzhledem k tomu, že rozpustný p94 je extrémně rychle degradovatelný a má poločas rozpadu 30 minut – vazebná místa pro p94 v titinu mohou fungovat tak, že sekvestrují proteázu kalpain do komplexně stabilizovaného stavu. Zajímavé je, že C-koncový vazebný motiv p94 v titinu je v některých svalových tkáních vynechán v důsledku diferenciálního sestřihu,38 což interakcím mezi p94 a titinem dodává další úroveň složitosti a zvyšuje možnost tkáňově specifické kontroly stability titinu.

Patofyziologické aspekty

Nakonec nás molekulární pochopení interakcí mezi titinovým vláknem a p94 nebo jinými kalpainovými proteázami může odměnit důkladnějším pochopením svalové degenerace a regenerace, zejména s ohledem na patofyziologickou situaci. Pečlivý průzkum proteinů přítomných ve svalových biopsiích od normálních a dystrofických pacientů odhalil degradaci titinu u DMD a FCMD.39 Nedávno bylo zjištěno, že mutace ve svalově specifické kalpainové proteáze p94 způsobují LGMD-2A.40 Jelikož titin poskytuje specifická vazebná místa pro p94,16 nabízí se zajímavá možnost, že geneticky odlišné svalové dystrofie, jako jsou FCMD, DMD a LGMD-2A, mají společnou dysregulaci interakce p94-titin, která pak vede k patologické křehkosti systému titinových vláken jako společnému, sekundárnímu mechanismu onemocnění.

Shrnem lze říci, že titinová vlákna hrají důležitou roli ve fyziologickém i patofyziologickém fungování svalu. Zatímco pravidelná struktura titinu v pásmu A se zdá být rozhodující pro uspořádanou sestavu sarkomery, je zřejmé, že elasticita titinu v pásmu I určuje pasivní mechanické vlastnosti myofibril. V budoucnu se lepší molekulární pochopení elastických vlastností titinu v pásmu I může vyvinout na základě kombinovaného přístupu s využitím biofyzikálních i molekulárně biologických technik. Pokud jde o potenciální kinázovou aktivitu titinu a jeho předpokládanou roli v přenosu signálu, stále čekáme na podrobnější zkoumání. A konečně, k dalšímu odhalení účasti titinu v patofyziologických procesech bude nutné studovat exprimované titinové moduly z hlediska možných interakcí s jinými myofibrilárními a cytosolickými proteiny, a tím funkčně charakterizovat tyto interakce na molekulární úrovni.

Vybrané zkratky a akronymy

Poznámky

.