Det gigantiske protein Titin

Standardproteingels med et akrylamidindhold på mellem 6 og 15 % er normalt blevet brugt til at påvise proteinbånd i 10-200 kD-området. Da denne metode udelukker påvisning af større proteiner, var det kun to årtier siden, at forskere opdagede et nyt gigantisk protein med en ekstremt lav tilsyneladende mobilitet ved at bruge ukonventionelle 2%-geler. Molekylmassen af dette nye protein, titin1 (også kaldet connectin2 ), blev tidligere anslået til at ligge mellem 1,2 og 3,0 MD (se referencerne 3 og 4 for oversigter). Når intensiteten af titinbåndene på SDS-geler sammenlignes med intensiteten af andre myofibrillære proteiner, viser det sig, at titin efter myosin og actin er det tredje hyppigste muskelprotein, idet det udgør ≈10% af det samlede muskelproteinindhold. Et voksent menneske med en kropsvægt på 80 kg kan således indeholde ca. et halvt kilo titin. I betragtning af dets overflod er titins sene opdagelse ret overraskende.

I løbet af 1980’erne havde elektronmikroskopiske undersøgelser med titin-specifikke antistoffer vist, at titin er en integreret del af myofibrillen. Det blev vist, at enkelte titinmolekyler spænder fra Z-skiven til M-linjen og dermed danner et tredje sarkomerisk filamentsystem ud over de tykke (hovedsagelig myosin) og tynde (hovedsagelig actin) filamenter.5 I overensstemmelse hermed har rensede native titinmolekyler, der er visualiseret ved elektronmikroskopi, vist sig at være >1 μm lange.6 Desuden fremstod disse molekyler som en stang med en perleformet understruktur,6 fordi deres peptidkæder hovedsageligt består af Ig-lignende og FN3-lignende gentagelser,7 som foldes til kugleformede domæner og udgør næsten 90 % af titins masse (Fig. 1). I A-båndet er disse gentagelser arrangeret i meget ordnede mønstre og hjælper med at organisere den tykke filamentstruktur ved at give regelmæssigt adskilte bindingssteder til andre A-båndsproteiner, især let meromyosin og C-protein (for gennemgang, se reference 15). På grund af en tæt tilknytning til tyk-filamentproteinerne er titins A-båndsdel funktionelt stiv under fysiologiske forhold. I modsætning hertil er titins I-båndsdel elastisk.517 Når titinfilamenter trækkes ud af sarkomeren eller nedbrydes af stråling eller proteaser, falder stivheden af den afslappede myofibrille (se referencerne 3 og 4 for en gennemgang). For nylig er det blevet vist, at titin bærer det meste af hvilespændingen under fysiologiske strækninger, både i skelet- og hjertemuskler.1819

Molekylære tilgange til undersøgelse af titins rolle i muskelstruktur og elasticitet er blevet lettere efter bestemmelse af cDNA-sekvensen af humane skelet- og hjertetitiner.8 Som tidligere antydet ud fra de forskellige mobiliteter af skelet- og hjertetitiner på SDS-geler2021 står det nu klart, at titin udtrykkes i forskellige isoformer i forskellige muskelvæv.8 Human hjertetitin er f.eks. kodet af et gigantisk mRNA på 82 kb, som indeholder en 81 kb åben læseramme, der koder for et peptid med 27 000 residualer (Mr, 2993 kD). I modsætning hertil er humant soleus-titin et betydeligt større polypeptid med en molekylmasse på ≈3700 kD. Disse forskelle er resultatet af en række alternative splejsning af I-band titin i de forskellige muskelvæv. 8

Elasticitet af titin

Når afslappede tværstribede muskelfibre strækkes, opstår der en tilbagetrækningskraft, som betegnes som passiv eller hvilespænding (stivhed). Det har længe været kendt, at hjertemuskulaturen er meget stivere end skeletmuskulaturen. Tidligere troede man, at den høje passive stivhed i hjertemuskelvævet hovedsagelig skyldtes den lave eftergivelighed af ekstracellulære strukturer som f.eks. kollagen,22 men med fremkomsten af det enkelte myocytpræparat23 blev det klart, at stive strukturer må være placeret, i det mindste delvist, inden for cellen.2425 De stive ekstracellulære elementer, som er med til at forhindre overstrækning af muskelvævet, findes måske kun ved mere ekstreme belastninger. For nylig kunne det også påvises, at der udvikles en betydelig passiv kraft ved strækning af afslappede, enkelte, isolerede myofibriller, idet hjerteprøver er ca. en størrelsesorden stivere end skeletpræparater.19 Disse stivhedsforskelle vides nu at skyldes den muskeltypespecifikke ekspression af titinvarianter af forskellig længde eller mere præcist den differentielle ekspression af to forskellige titinmotivfamilier i I-båndet (fig. 1).813 Den ene motivtype er repræsenteret af tandem-arrangerede Ig-domæner. Den stiveste tværstribede muskel hos hvirveldyr, hjertet, udtrykker 40 tandem-Ig-domæner, mens den meget mere eftergivelige soleus-muskel udtrykker 93 tandem-Ig-domæner. Det andet differentielt udtrykte I-band-titinsegment er en særskilt motivtype kaldet PEVK-domænet, fordi prolin-, glutamat-, valin- og lysinrester udgør ≈70 % af dets sekvens8 . Dette PEVK-domæne er også kortest i hjertet og meget længere i skeletmuskulaturen: den menneskelige PEVK-region i hjertet består af 163 rester, mens den menneskelige PEVK-region i soleus har ≈2200 rester (Fig 1).8

Den opdagelse af differentiel ekspression af både PEVK- og tandem-Ig-regionerne af titin har gjort det nødvendigt at identificere det relative bidrag fra disse to forskellige I-band-segmenter til myofibrillenelasticitet. En sådan identifikation er for nylig blevet forsøgt ved at overvåge placeringen af udvalgte I-band titin-antistof-epitoper i strækkede enkelte myofibriller13 eller muskelfibre,14 ud over at måle prøvernes passive spændingsrespons (Fig. 2; sammenlign med Reference 13 ). Det blev foreslået, at ved slap sarkomerlængde er I-band titindomæner i kompakt tilstand, mens en lille strækning kan inducere en opretning af tandem-Ig-regionerne.13142728 Denne indledende udvidelse er kun korreleret med en lille (hjertemuskel) eller endog ubetydelig (skeletmuskel) passiv spændingsforøgelse202125 og kan således ikke være forårsaget af udfoldning af tandem-Ig-moduler, som har vist sig at folde sig uafhængigt til termodynamisk stabile domæner.9 Ved moderate til lange strækninger synes den vigtigste udvidelse at ske inden for PEVK-regionen, i det mindste i skeletmyofibriller1314 , mens den passive spænding stiger støt (Fig. 2). I hjertemyofibriller kan den korte PEVK-region8 også understøtte passiv spænding, men kun i begrænset omfang (sammenlign med legenden til fig. 2). Når PEVK-segmentets strækbarhed er udtømt, kan den passive spænding muligvis hovedsagelig bestemmes af udfoldning af Ig-domæner2728 ; da den maksimale længde af hjertesarcomerer imidlertid ikke overstiger ≈2,4 μm in vivo, er det usandsynligt, at en sådan udfoldning finder sted under fysiologiske forhold.13

Sammenfattende tyder den høje strækbarhed af PEVK-regionen under fysiologiske strækningsmængder1314 på, at dette domæne er i stand til at udfolde sig til en forlænget polypeptidkæde. Derfor kan titins PEVK-region og tandem-Ig-domænerne udgøre et system med to fjedre, der virker i serie. Den vævsspecifikke ekspression af begge fjedre i forskellige længdevarianter kan nu forklare, hvorfor de passive mekaniske egenskaber af tværstribede muskler er så forskellige. Ekspression af forskellige tandem-Ig-segmentlængder i forskellige muskeltyper kunne være vigtig for fastsættelsen af den fysiologiske slappe sarkomerlængde, mens differentiel splejsning af PEVK-rige sekvenser kan kontrollere den karakteristiske stivhed af et afslappet muskelvæv. En vigtig opgave er nu at afdække, hvilken tertiær struktur der gør det muligt for PEVK-regionen af titin at undergå de massive og hurtigt reversible konformationsændringer, der hovedsagelig bestemmer myofibrillær passiv spænding og elasticitet.

Emerging Roles of Titin in Muscle Cell Biology

På nuværende tidspunkt er det ukendt, hvilke cellulære signaltransduktionsmaskinerier der kan kontrollere oversættelsen, samlingen og også demonteringen og omsætningen af det gigantiske titin-polypeptid under myogenese og vækst. Titin indeholder hundredvis af bindingssteder for myosin, C-protein og M-line proteiner715 og sandsynligvis for et betydeligt antal endnu ikke identificerede Z-disk- og I-band proteiner. Hvordan kontrollerer muskelcellen så oversættelsen af titinpeptidet med 27 000 til 33 000 residualer, og hvordan kan titinsyntesen være tæt koblet med samlingen af titinligander under myogenesen? En attraktiv model ville være, at titin-, myosin- og C-protein-mRNA’er er kolokaliseres og samles cotranslationelt,29 hvorved de spirende peptidkæder tvinges ind i proteinnetværket af den parakristallinske orden, der findes in vivo. Det er klart, at en bedre forståelse af, hvordan den supramolekylære samling af titin/tykkelfilamenter er i stand til at udgøre et højt ordnet tredimensionelt netværk, nu må komme fra en biokemisk karakterisering af udtrykte titin-, myosin- og C-proteinfragmenter og måske fra undersøgelser af titins mRNA-metabolisme.

En anden mekanisme til kontrol af titinfilamentets samling kan være antydet i nogle karakteristiske træk ved titinsekvensen: Ud over PEVK-regionen og de 244 til 297 kopier af Ig- og FN3-strukturelle gentagelser (afhængig af muskeltype) indeholder titin også 19 unikke sekvensindsættelser, som tilsammen udgør ≈300 kD eller 8 % til 10 % af titins masse.8 To unikke sekvensindsættelser, der er placeret i de N-terminale og C-terminale titinregioner, koder for tandem-arrangementer af SP-motiver (Fig. 1). Serinresterne i SP-repeterne kan fosforyleres in vitro af muskelekstrakter,3031 og dette kunne forklare, hvorfor titin bliver hurtigt mærket in vivo, når fosfat injiceres i dyr.32 Muligvis kan endnu uidentificerede fosforylerings-/affosforyleringsveje således kontrollere titinfilamentets samling. I fremtiden skulle det være interessant at undersøge de funktionelle konsekvenser af fosforylering ved titins Z-skive og M-linjens ender.

En af de unikke sekvensindsættelser i titin, der er placeret tæt på C-terminus, koder for et serin/threoninkinase-domæne (Fig 1).7 Dette domæne og organiseringen af flankerende Ig- og FN3-repeats minder meget om dem i de gigantiske hvirvelløse dyrs proteiner, twitchin og projectin.3334 I kinase-domænerne af både twitchin og titin er der påvist calmodulinbindingssteder.3536 For nylig er twitchinkin-kinasen fra bløddyret Aplysia blevet vist at blive aktiveret med flere størrelsesordener gennem den allestedsnærværende calciumregulerede cofaktor S100.37 Det forekommer derfor sandsynligt, at twitchin- og måske også titin-filamenterne repræsenterer et nyt calciumfølsomt filamentsystem i musklen. På trods af den voksende indsigt i de faktorer, der styrer titin/twitchin-kinasernes aktivitet på kunstige substrater, er disse kinasers ægte substrat (og dermed deres fysiologiske rolle) fortsat ukendt.

For bedre at forstå fysiologien af titin-sammensætning/nedbrydning på molekylært niveau kan opdagelsen af specifikke bindingssteder på titin for calpainproteasen p94,16 være et vigtigt skridt (sammenlign med fig. 1). I modsætning til de allestedsnærværende calpainer, der udtrykkes i alle celletyper, udtrykkes p94 kun i muskelvæv. Ved at bruge p94 som lokkemad til en gær to-hybrid-screening blev der identificeret to forskellige p94-bindende loci på titinfilamentet.16 Det første sted er placeret i det centrale område af I-band-titin. Muligvis kan spaltning af titin på dette sted af p94 eller p94-regulerede proteaser forklare, hvorfor titin let nedbrydes til det såkaldte T2-titin (eller beta-connectin).3 Derefter kan T2 være et fysiologisk nedbrydningsprodukt af titin, der er involveret i myofibrillær omsætning. Desuden er det andet bindingssted på titin for p94 placeret ved filamentets C-terminale ende, hvilket falder sammen med den sidste unikke sekvensindsættelse af titin (Fig. 1). Selv om det er uklart, hvorfor der er mindst to forskellige bindingssteder for p94 i titin, er det en mulighed, at – eftersom det opløselige p94 er ekstremt hurtigt nedbrydeligt og har en halveringstid på 30 minutter – kan p94-bindingssteder i titin fungere som sekventering af calpainproteasen til en kompleksstabiliseret tilstand. Det er interessant, at det C-terminale p94-bindende motiv i titin springes over i nogle muskelvæv ved differentiel splejsning,38 hvilket tilføjer et yderligere kompleksitetsniveau til interaktionerne mellem p94 og titin og rejser muligheden for en vævsspecifik kontrol af titinstabiliteten.

Patofysiologiske aspekter

Endeligt kan en molekylær forståelse af interaktionerne mellem titinfilamentet og p94 eller andre calpainproteaser belønne os med en mere grundig forståelse af muskeldegeneration og -regeneration, især med hensyn til den patofysiologiske situation. En omhyggelig undersøgelse af de proteiner, der er til stede i muskelbiopsier fra normale og dystrofiske patienter, afslørede nedbrydning af titin i DMD og FCMD.39 For nylig blev det konstateret, at mutationer i den muskelspecifikke calpainprotease p94 er årsag til LGMD-2A.40 Da titin giver specifikke bindingssteder for p94,16 opstår den spændende mulighed, at genetisk forskellige muskeldystrophier, såsom FCMD, DMD og LGMD-2A, deler en dysregulering af p94-titin-interaktionen, som derefter fører til en patologisk skrøbelighed af titinfilamentsystemet som en fælles, sekundær sygdomsmekanisme.

Sammenfattende spiller titinfilamenter en vigtig rolle i både den fysiologiske og patofysiologiske funktion af muskler. Mens en regelmæssig titinstruktur i A-båndet synes at være afgørende for en ordnet sarkomeropsamling, er det klart, at elasticiteten af titin i I-båndet bestemmer myofibrillenes passive mekaniske egenskaber. I fremtiden kan en forbedret molekylær forståelse af de elastiske egenskaber ved I-båndets titin muligvis udvikles ved hjælp af en kombineret tilgang, hvor der anvendes både biofysiske og molekylærbiologiske teknikker. Hvad angår titins potentielle kinaseaktivitet og dets forventede rolle i signaltransduktion, afventer vi stadig en mere detaljeret udforskning. Endelig vil det for yderligere at afdække titins involvering i patofysiologiske processer være nødvendigt at undersøge udtrykte titinmoduler for mulige interaktioner med andre myofibrillære og cytosoliske proteiner og derved funktionelt karakterisere disse interaktioner på molekylært niveau.

Udvalgte forkortelser og akronymer

Fodnoter