Det gigantiska proteinet Titin

Standardproteingeler med en akrylamidhalt på 6-15 % har vanligen använts för att upptäcka proteinband i intervallet 10-200 kD. Eftersom denna metod utesluter upptäckt av större proteiner var det först för två decennier sedan som forskare upptäckte ett nytt gigantiskt protein med extremt låg skenbar rörlighet genom att använda okonventionella 2-procentiga geler. Molekylmassan för detta nya protein, titin1 (även kallat connectin2 ), uppskattades tidigare till mellan 1,2 och 3,0 MD (för översikter, se referenserna 3 och 4). När intensiteten hos titinbanden på SDS-geler jämförs med intensiteten hos andra myofibrillära proteiner visar det sig att titin, efter myosin och aktin, är det tredje vanligaste muskelproteinet och utgör ≈10 % av det kombinerade muskelproteininnehållet. En vuxen människa med 80 kg kroppsvikt kan således innehålla ungefär ett halvt kilo titin. Med tanke på dess rikedom är titins sena upptäckt ganska överraskande.

Under 1980-talet hade elektronmikroskopiska studier med titinspecifika antikroppar visat att titin är en integrerad del av myofibrillen. Enskilda titinmolekyler visades sträcka sig från Z-skivan till M-linjen och bildar därmed ett tredje sarkomeriskt filamentsystem, vid sidan av de tjocka (mestadels myosin) och tunna (mestadels aktin) filamenten.5 Följaktligen har renade nativa titinmolekyler som visualiserats med hjälp av elektronmikroskopi visat sig vara >1 μm långa.6 Dessutom framstod dessa molekyler som en stav med en pärlformad understruktur,6 eftersom deras peptidkedjor huvudsakligen består av Ig-liknande och FN3-liknande upprepningar,7 som vecklar sig till globulära domäner och står för nästan 90 % av titins massa (fig. 1). I A-bandet är dessa upprepningar ordnade i mycket ordnade mönster och hjälper till att organisera den tjocka filamentstrukturen genom att tillhandahålla regelbundet fördelade bindningsställen för andra A-bandproteiner, särskilt lätt meromyosin och C-protein (för en översikt, se referens 15). På grund av en tät förening med proteinerna i de tjocka filamenten är titins A-bandsdel funktionellt styv under fysiologiska förhållanden. Däremot är titins I-bandsdel elastisk.517 När titinfilamenten extraheras från sarkomeren eller bryts ned av strålning eller proteaser minskar styvheten hos den avslappnade myofibrillen (för en översikt, se referenserna 3 och 4). På senare tid har det visat sig att titin bär den största delen av vilospänningen under fysiologiska utdragningar, både i skelett- och hjärtmuskulaturen.1819

Ansatser på molekylär nivå för att undersöka titins roll i muskelns struktur och elasticitet har blivit lättare efter att cDNA-sekvensen för humant skelett- och hjärttitin har bestämts.8 Som tidigare antytts av de olika mobiliteterna hos skelett- och hjärttitiner på SDS-geler,2021 står det nu klart att titin uttrycks i olika isoformer i olika muskelvävnader.8 Mänskligt hjärttitin kodas till exempel av ett jättestort mRNA på 82 kb, som innehåller en öppen läsram på 81 kb som kodar för en peptid med 27 000 residualer (Mr, 2993 kD). Däremot är humant titin från soleus en betydligt större polypeptid med en molekylmassa på ≈3700 kD. Dessa skillnader är resultatet av en rad alternativa splicinghändelser av I-bandet titin i de olika muskelvävnaderna.8

Elasticitet hos titin

När avslappnade streckade muskelfibrer sträcks ut resulterar det i en indragningskraft, som kallas passiv eller vilospänning (styvhet). Det har länge varit känt att hjärtmuskeln är mycket styvare än skelettmuskulaturen. Tidigare trodde man att den höga passiva styvheten hos hjärtmuskelvävnad främst berodde på den låga följsamheten hos extracellulära strukturer, t.ex. kollagen,22 men i och med tillkomsten av det enskilda myocytpreparatet23 blev det klart att styva strukturer måste finnas, åtminstone delvis, inom cellen.2425 De styva extracellulära delarna, som hjälper till att förhindra att muskelvävnaden översträcks, finns kanske bara vid mer extrema påfrestningar. Nyligen kunde det också påvisas att en betydande passiv kraft utvecklas vid sträckning av avslappnade, enskilda, isolerade myofibriller, där hjärtprover är ungefär en storleksordning styvare än skelettpreparat.19 Dessa skillnader i styvhet vet man nu att de är ett resultat av det muskeltypsspecifika uttrycket av olika långa varianter av titin, eller närmare bestämt av det differentiella uttrycket av två distinkta titinmotivfamiljer i I-bandet (fig. 1).813 Den ena motivtypen representeras av tandemvis arrangerade Ig-domäner. Den styvaste streckade muskeln hos ryggradsdjur, hjärtat, uttrycker 40 tandem-Ig-domäner, medan den mycket mer följsamma soleusmuskeln uttrycker 93 tandem-Ig-domäner. Det andra differentiellt uttryckta titinsegmentet i I-bandet är en distinkt motivtyp som kallas PEVK-domänen, eftersom prolin-, glutamat-, valin- och lysinrester utgör ≈70 % av dess sekvens.8 Denna PEVK-domän är också kortast i hjärtat och mycket längre i skelettmuskulaturen: den mänskliga PEVK-regionen i hjärtat består av 163 rester, medan den mänskliga PEVK-regionen i soleus har ≈2200 rester (fig. 1).8

Upptäckten av differentiellt uttryck av både PEVK- och tandem-Ig-regionerna i titin har gjort det nödvändigt att identifiera det relativa bidraget från dessa två distinkta I-bandsegment till myofibrillans elasticitet. En sådan identifiering har nyligen försökts genom att övervaka placeringen av utvalda titin-antikroppsepitoper för I-bandet i sträckta enskilda myofibriller13 eller muskelfibrer,14 förutom att mäta den passiva spänningsresponsen hos proverna (fig. 2; jämför med referens 13 ). Det föreslogs att vid slapp sarkomerlängd befinner sig I-bandtitindomänerna i kompakt tillstånd, medan en liten sträckning kan inducera en uträtning av tandem-Ig-regionerna.13142728 Denna initiala utbredning korrelerar endast med en liten (hjärtmuskel) eller till och med försumbar (skelettmuskel) ökning av den passiva spänningen202125 och kan således inte åstadkommas av en utvikning av tandem-Ig-moduler, som har visats veckla sig oberoende av varandra till termodynamiskt stabila domäner.9 Vid måttliga till långa sträckningar tycks den huvudsakliga förlängningen ske inom PEVK-regionen, åtminstone i skelettmyofibriller1314 , medan den passiva spänningen ökar stadigt (fig. 2). I hjärtmyofibriller kan den korta PEVK-regionen8 också stödja den passiva spänningen, men endast i begränsad utsträckning (jämför med legend till fig. 2). När PEVK-segmentets utdragbarhet har uttömts kan den passiva spänningen huvudsakligen bestämmas av utvikning av Ig-domäner2728 ; eftersom den maximala längden på hjärtats sarkomerer inte överstiger ≈2,4 μm in vivo är det dock osannolikt att en sådan utvikning sker under fysiologiska förhållanden.13

Sammanfattningsvis tyder den höga utdragbarheten hos PEVK-regionen under fysiologiska sträckningsmängder1314 på att denna domän kan utspela sig till en förlängd polypeptidkedja. Därför kan titins PEVK-region och tandem-Ig-domänerna utgöra ett system med två fjädrar som verkar i serie. Det vävnadsspecifika uttrycket av båda fjädrarna i olika längdvarianter kan nu förklara varför de passiva mekaniska egenskaperna hos de streckade musklerna är så olika. Uttryck av olika tandem-Ig-segmentlängder i olika muskeltyper kan vara viktigt för att fastställa den fysiologiska slappa sarkomerlängden, medan differentiell splicing av PEVK-rika sekvenser kan styra den karakteristiska styvheten hos en avslappnad muskelvävnad. En viktig uppgift är nu att avslöja vilken tertiärstruktur som gör det möjligt för titinets PEVK-region att genomgå de massiva och snabbt reversibla konformationsförändringar som huvudsakligen bestämmer myofibrillärernas passiva spänning och elasticitet.

Titins framväxande roller i muskelcellsbiologin

För närvarande är det okänt vilka cellulära signaltransduktionsmaskinerier som kan styra översättningen, sammansättningen och även nedmonteringen och omsättningen av den jättelika titinpolypeptiden under myogenes och tillväxt. Titin innehåller hundratals bindningsställen för myosin, C-protein och M-line proteiner715 och troligen för ett betydande antal ännu inte identifierade Z-disk- och I-bandproteiner. Hur kontrollerar muskelcellen då översättningen av titinpeptiden med 27 000 till 33 000 residualer, och hur kan titinsyntesen vara tätt kopplad till sammansättningen av titinligander under myogenesen? En attraktiv modell skulle vara att mRNA:erna för titin, myosin och C-protein är kolokaliserade och kotranslationellt sammansatta,29 vilket tvingar in de framväxande peptidkedjorna i proteinnätverket i den parakristallina ordning som finns in vivo. Det är uppenbart att en bättre förståelse för hur den supramolekylära sammansättningen av titin/tjockfilament kan utgöra ett högt ordnat tredimensionellt nätverk nu måste komma från en biokemisk karakterisering av uttryckta titin-, myosin- och C-proteinfragment och kanske från studier av titins mRNA-metabolism.

En annan mekanism för att kontrollera titinfilamentens sammansättning kan antydas i vissa karakteristiska egenskaper hos titinsekvensen: förutom PEVK-regionen och 244 till 297 kopior av Ig- och FN3-strukturella upprepningar (beroende på muskeltyp) innehåller titin också 19 unika sekvensinsatser, som tillsammans utgör ≈300 kD, eller 8 % till 10 %, av titinets massa.8 Två unika sekvensinsatser, belägna i de N-terminala och C-terminala titinregionerna, kodar för tandemställda SP-motiv (fig. 1). Serinresterna i SP-repetitionerna kan fosforyleras in vitro av muskelextrakt,3031 och detta skulle kunna förklara varför titin blir snabbt märkt in vivo när fosfat injiceras i djur.32 Möjligen kan ännu oidentifierade fosforylerings- och defosforyleringsvägar på så sätt styra titinfilamentens sammansättning. I framtiden borde det vara intressant att undersöka de funktionella konsekvenserna av fosforylering vid titins Z-skiva och M-linjens ändar.

En av de unika sekvensinsatserna hos titin som är belägen nära C-terminalen kodar för en serin/treoninkinasdomän (fig. 1).7 Denna domän och organiseringen av flankerande Ig- och FN3-repetitioner liknar i hög grad de som finns hos de jättelika ryggradslösa djurs proteiner, twitchin och projectin.3334 I kinasdomänerna hos både twitchin och titin har calmodulinbindningsställen påvisats.3536 Nyligen har twitchinkinaset från blötdjuret Aplysia visats aktiveras med flera storleksordningar genom den allestädes närvarande kalciumreglerade kofaktorn S100.37 Därför verkar det troligt att twitchin- och kanske även titin-filamenten representerar ett nytt kalciumkänsligt filamentsystem i muskeln. Trots de ökande insikterna om de faktorer som kontrollerar aktiviteten hos titin/twitchinkin-kinaserna på konstgjorda substrat är dessa kinasers genuina substrat (och därmed deras fysiologiska roll) fortfarande okänt.

För att bättre förstå fysiologin vid sammansättning/avveckling av titin på molekylär nivå kan upptäckten av specifika bindningsställen på titin för calpainproteaset, p94,16, vara ett viktigt steg (jämför med fig. 1). Till skillnad från de allestädes närvarande calpainerna som uttrycks i alla celltyper, uttrycks p94 endast i muskelvävnad. Genom att använda p94 som lockbete för en jäst tvåhybridscreening identifierades två distinkta p94-bindande loci på titinfilamentet.16 Den första platsen är belägen i den centrala regionen av I-bandstitin. Möjligen kan klyvning av titin på denna plats av p94 eller p94-regulerade proteaser förklara varför titin lätt bryts ned till det så kallade T2-titinet (eller beta-connectin).3 Då kan T2 vara en fysiologisk nedbrytningsprodukt av titin som är inblandad i myofibrillär omsättning. Vidare är den andra bindningsplatsen på titin för p94 belägen vid filamentets C-terminala ände, vilket sammanfaller med den sista unika sekvensinsättningen av titin (fig. 1). Även om det är oklart varför minst två olika bindningsställen för p94 finns i titin, är en möjlighet att – eftersom det lösliga p94 är extremt snabbt nedbrytbart och har en halveringstid på 30 minuter – kan p94-bindningsställen i titin fungera som sekvensering av calpainproteaset till ett komplext stabiliserat tillstånd. Intressant nog är det C-terminala p94-bindningsmotivet i titin hoppat över i vissa muskelvävnader genom differentiell splicing,38 vilket ger ytterligare en komplexitetsnivå till interaktionerna mellan p94 och titin och ger möjlighet till en vävnadsspecifik kontroll av titinstabiliteten.

Patofysiologiska aspekter

Enligt kan en molekylär förståelse av interaktionerna mellan titinfilamentet och p94 eller andra calpainproteaser belöna oss med en grundligare förståelse av muskeldegeneration och regeneration, med särskild hänsyn till den patofysiologiska situationen. En noggrann undersökning av de proteiner som finns i muskelbiopsier från normala och dystrofa patienter avslöjade nedbrytning av titin vid DMD och FCMD.39 Nyligen visade sig mutationer i det muskelspecifika calpainproteaset p94 orsaka LGMD-2A.40 Eftersom titin tillhandahåller specifika bindningsställen för p94,16 uppstår den spännande möjligheten att genetiskt distinkta muskeldystrofier, såsom FCMD, DMD och LGMD-2A, delar en dysreglering av samspelet mellan p94 och titin, vilket sedan leder till en patologisk bräcklighet hos titinfilamentsystemet som en gemensam, sekundär sjukdomsmekanism.

Sammanfattningsvis spelar titinfilamenten en viktig roll i både den fysiologiska och patofysiologiska funktionen hos muskler. Medan en regelbunden titinstruktur i A-bandet tycks vara kritisk för en ordnad sarkomerkonstruktion är det tydligt att elasticiteten hos titin i I-bandet bestämmer de passiva mekaniska egenskaperna hos myofibrillerna. I framtiden kan en förbättrad molekylär förståelse av de elastiska egenskaperna hos titin i I-bandet utvecklas genom ett kombinerat tillvägagångssätt med användning av både biofysikaliska och molekylärbiologiska tekniker. När det gäller titins potentiella kinasaktivitet och dess förväntade roll i signaltransduktionen väntar vi fortfarande på en mer detaljerad undersökning. För att ytterligare avslöja titins inblandning i patofysiologiska processer kommer det slutligen att bli nödvändigt att studera uttryckta titinmoduler för möjliga interaktioner med andra myofibrillära och cytosoliska proteiner och därigenom funktionellt karakterisera dessa interaktioner på molekylär nivå.

Utvalda förkortningar och akronymer

Fotnoter