PMC

GENOMI-ILMOITUS

F. William Studierin ja Barbara A. Moffattin (1 ) luomat BL21- ja BL21(DE3)-kannat ovat yleisiä laboratoriokantoja, joita käytetään proteiinien yhdistelmätuotantoon. Lon- ja ompT-proteaasien puute, joita pidetään usein B-linjan yhteisinä ominaisuuksina, on johtanut näiden kantojen kehittämiseen proteiiniekspressioisänniksi. E. coli BL21(DE3), joka on BL21:n johdannainen, on luultavasti laajimmin käytetty rekombinanttiproteiinien korkean tason ekspressiossa, ja se sisältää bakteriofaagista λ peräisin olevaa DE3-profaagia, joka kantaa T7 RNA-polymeraasigeeniä lacUV5-promoottorin ohjaamana. E. coli BL21:tä on käytetty rutiininomaisesti muuhun kuin T7-ekspressioon, ja sitä on myös hiljattain muutettu plasmidi-DNA-rokotteen tuottamiseen, koska se toimii paremmin suuren solutiheyden syöttöeräviljelmissä kuin K-12-kannat (2).

E. coli BL21(DE3)-bakteerin genomisekvenssi määritettiin aiemmin laitoksessamme (3). Periaatteessa BL21:n genomisekvenssi olisi identtinen BL21(DE3):n kanssa lukuun ottamatta DE3-profaagia. Kantojen välillä voi kuitenkin esiintyä variaatioita, joilla voi olla vakavia vaikutuksia kokeisiin (4). E. coli BL21(DE3):n genomitietoja referenssinä käyttäen BL21:n täydellinen genomisekvenssi rakennettiin käyttäen ainoastaan seuraavan sukupolven sekvensointia, ja emäskohtaiset genomierot tunnistettiin.

E. coli BL21 -kanta ostettiin TaKaRa Bio:lta (koodinumero 9126, eränumero K142). Genomin sekvensointi suoritettiin Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) Human Derived Material Centerissä Illumina HiSeq 2000 -järjestelmällä. BL21:n täydellinen genomisekvenssi tuotettiin sekä laaditulla referenssikartoituksella että de novo -assemblaatiolla 101 nt:n Illumina-lukemista (47 123 524 pareittain päättynyttä lukemaa ~150-bp:n kirjastosta) käyttäen CLC Genomics Workbench -ohjelman versiota 6.5.1 (CLC bio).

Olimme odottaneet, että muunnettu BL21(DE3)-genomisekvenssi (CP001509.3) – josta poistettiin profaagialue, jolloin jäljelle jäi yksi kopio lambdan kiinnityskohdasta (attB) – toimisi parhaana referenssisekvenssinä. Ensimmäisen kartoituksen kattavuusanalyysi osoitti kuitenkin, että BL21:n attB ei ollut tyhjä, vaan sen oli vallannut 12,1 kt:n pituinen λ*B-profaagi, kuten E. coli REL606:ssa (3), jonka on raportoitu olevan yleinen piirre B-linjan keskuudessa (5). Toinen referenssikartoituskokeilu, jossa käytettiin muunnettua sekvenssiä, jossa oli λ*B-profaagisekvenssi, paljasti toisen vähän kattavan alueen ybhC-geenin ja lambdan kiinnittymiskohdan, attL:n, vasemman reunan välissä. Sekvenssivertailun avulla paras vastaava sekvenssi tunnistettiin de novo kootuista kontigeista, ja se oli 23 bp pidempi kuin vastaava alue BL21(DE3:sta). Tämän jälkeen laadittiin päivitetty referenssisekvenssi korvaamalla matalan kattavuuden alue ja sen naapuri (~200 bp), ja kartoitus suoritettiin uudelleen. Tasainen lukupeitto koko lopullisessa referenssisekvenssissä vahvistettiin visuaalisella tutkimuksella, eikä muita eroja havaittu laatupohjaisella SNV/rakenteellisen vaihtelun havaitsemisella tai katkaisupisteanalyysillä. Yhdistäminen kartoittamattomien lukujen avulla ei tuottanut yhtään kontigia, joka voisi tukea BL21-spesifisten alueiden olemassaoloa. Genomin annotointi suoritettiin NCBI:n Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline (PGAAP) -palvelun avulla.