The Giant Protein Titin

Standardiproteiinigeelejä, joiden akryyliamidipitoisuus on 6-15 %, on yleisesti käytetty havaitsemaan 10-200 kD:n proteiinikaistoja. Koska tällä menetelmällä ei voida havaita suurempia proteiineja, vasta kaksi vuosikymmentä sitten tutkijat löysivät uudenlaisen jättiläisproteiinin, jolla on erittäin alhainen näennäinen liikkuvuus, käyttämällä epätavanomaisia 2 prosentin geelejä. Tämän uuden proteiinin, titiini1:n (jota kutsutaan myös nimellä connectin2 ), molekyylimassan arvioitiin aiemmin olevan 1,2-3,0 MD (ks. katsaukset viitteissä 3 ja 4). Kun titiinibändien intensiteettiä SDS-geeleillä verrataan muiden myofibrillaaristen proteiinien intensiteettiin, näyttää siltä, että titiini on myosiinin ja aktiinin jälkeen kolmanneksi runsain lihasproteiini, ja sen osuus on ≈10 % lihaksen yhteenlasketusta proteiinipitoisuudesta. Aikuinen ihminen, jonka ruumiinpaino on 80 kg, voi siis sisältää noin puoli kiloa titiinia. Ottaen huomioon titiinin runsauden sen myöhäinen löytyminen on varsin yllättävää.

1980-luvulla titiinispesifisillä vasta-aineilla tehdyt elektronimikroskooppiset tutkimukset olivat osoittaneet, että titiini on olennainen osa myofibrilliä. Yksittäisten titiinimolekyylien osoitettiin ulottuvan Z-levystä M-viivaan ja muodostavan siten kolmannen sarkomeerisen filamenttijärjestelmän paksujen (enimmäkseen myosiinia) ja ohuiden (enimmäkseen aktiiniä) filamenttien lisäksi.5 Vastaavasti elektronimikroskopialla visualisoitujen puhdistettujen natiivien titiinimolekyylien on todettu olevan >1 μm pitkiä.6 Lisäksi nämä molekyylit näyttäytyivät sauvoina, joilla oli helmimäinen alarakenne,6 koska niiden peptidiketjut koostuvat pääasiassa Ig:n kaltaisista ja FN3:n kaltaisista toistoista,7 jotka taittuvat pallomaisiksi domeeneiksi ja muodostavat lähes 90 prosenttia titiinin massasta (kuva 1). A-kaistassa nämä toistot ovat järjestäytyneet erittäin järjestäytyneisiin kuvioihin, ja ne auttavat järjestämään paksun säikeen rakennetta tarjoamalla säännöllisen välimatkan päässä toisille A-kaistan proteiineille, erityisesti kevyelle meromyosiinille ja C-proteiinille, sitoutumispaikkoja (ks. viite 15). Koska titiinin A-kaistan osa on tiiviissä yhteydessä paksun säikeen proteiineihin, se on fysiologisissa olosuhteissa toiminnallisesti jäykkä. Sitä vastoin titiinin I-kaistan osa on elastinen.517 Kun titiinifilamentit irrotetaan sarkomeerista tai hajotetaan säteilyn tai proteaasien vaikutuksesta, relaksoituneen myofibrillin jäykkyys vähenee (ks. katsaukset, ks. viitteet 3 ja 4). Viime aikoina on osoitettu, että titiini kantaa suurimman osan lepojännityksestä fysiologisten venytysten aikana sekä luurankolihaksessa että sydänlihaksessa.1819

Molekyylitason lähestymistavat titiinin roolin tutkimiseksi lihaksen rakenteessa ja elastisuudessa ovat helpottuneet sen jälkeen, kun ihmisen luurankolihasten ja sydänlihasten titiinien cDNA-sekvenssi on määritetty.8 Kuten luuston ja sydämen titiinien erilaisesta liikkuvuudesta SDS-geeleillä2021 on jo aiemmin saatu viitteitä, on nyt selvää, että titiini ilmentyy eri isomuotoina eri lihaskudoksissa.8 Esimerkiksi ihmisen sydämen titiiniä koodaa jättimäinen 82 kilotavun mRNA, joka sisältää 81 kilotavun kokoisen avoimen lukukehyksen, joka koodaa 27 000-residyylistä peptidiä (Mr, 2993 kD). Sen sijaan ihmisen soleuksen titiini on huomattavasti suurempi polypeptidi, jonka molekyylimassa on ≈3700 kD. Nämä erot ovat seurausta I-kaistan titiinin vaihtoehtoisista splikointitapahtumista eri lihaskudoksissa.8

Titiinin elastisuus

Kun rentoja raidallisia lihassäikeitä venytetään, syntyy vetäytymisvoima, jota kutsutaan passiiviseksi tai lepojännitykseksi (jäykkyydeksi). Jo pitkään on tiedetty, että sydänlihas on paljon jäykempi kuin luurankolihas. Aikaisemmin sydänlihaskudoksen suuren passiivisen jäykkyyden ajateltiin johtuvan lähinnä solunulkoisten rakenteiden, kuten kollageenin, alhaisesta mukautuvuudesta22 , mutta yksittäisen myosyyttipreparaatin23 käyttöönoton myötä kävi selväksi, että jäykkien rakenteiden on sijaittava ainakin osittain solun sisällä2425 . Jäykkiä solunulkoisia elementtejä, jotka auttavat estämään lihaskudoksen ylivenytyksen, saattaa esiintyä vain äärimmäisissä rasituksissa. Hiljattain voitiin myös osoittaa, että rentoja, yksittäisiä, eristettyjä myofibrillejä venytettäessä kehittyy merkittävä passiivinen voima, ja sydännäytteet ovat noin kertaluokkaa jäykempiä kuin luurankopreparaatit.19 Näiden jäykkyyserojen tiedetään nyt johtuvan siitä, että lihastyypille ominainen ilmentyminen johtuu titiinin eripituisten varianttien ilmentymisestä, tai täsmällisemmin sanottuna siitä, että I-kaistassa ilmentyy kaksi erilaista titiinimotiiviperhettä (kuva 1).813 Toista motiivityyppiä edustavat tandemmaisesti sijoitetut Ig-domeenit. Jäykin selkärankaisten raidallinen lihas, sydän, ilmentää 40 tandem-Ig-domeenia, kun taas paljon joustavampi soleus-lihas ilmentää 93 tandem-Ig-domeenia. Toinen eri tavoin ilmentyvä I-kaistan titiinisegmentti on erillinen motiivityyppi, jota kutsutaan PEVK-domeeniksi, koska proliini-, glutamaatti-, valiini- ja lysiinijäämät muodostavat ≈70 % sen sekvenssistä.8 . Tämä PEVK-domeeni on myös lyhin sydämessä ja paljon pidempi luurankolihaksessa: ihmisen sydämen PEVK-alue käsittää 163 jäännöstä, kun taas ihmisen soleuksen PEVK-alueella on ≈2200 jäännöstä (kuva 1).8

Titiinin PEVK- ja tandem-Ig-alueiden erilaisen ilmentymisen havaitseminen on tehnyt tarpeelliseksi tunnistaa näiden kahden erilaisen I-kaistasegmentin suhteellinen osuus sydänlihaksen kimmoisuuteen. Tällaista tunnistamista on hiljattain yritetty seurata seuraamalla valittujen I-kaistan titiinivasta-aineen epitooppien sijaintia venytetyissä yksittäisissä myofibrilleissä13 tai lihassyissä14 , minkä lisäksi on mitattu näytteiden passiivinen jännitysvaste (kuva 2; vertaa viite 13 ). On ehdotettu, että löysällä sarkomeerin pituudella I-kaistan titiinidomeenit ovat kompaktissa tilassa, kun taas pieni venytys voi aiheuttaa tandem-Ig-alueiden suoristumisen.13142728 Tämä alkupidennys korreloi vain pienen (sydänlihas) tai jopa merkityksettömän (luurankolihas) passiivisen jännityksen nousun kanssa202125 , ja se ei näin ollen välttämättä johdu tandem-Ig-moduulien avautumisesta (unfolding of tandem-Ig modules), sillä niiden on osoitettu taittuvan toisistaan riippumatta termodynaamisesti stabiileiksi domeeneiksi.9 Kohtalaisissa ja pitkissä venytyksissä päälaajeneminen näyttää tapahtuvan PEVK-alueella, ainakin luuston myofibrilleissä1314 , kun taas passiivinen jännitys kasvaa tasaisesti (kuva 2). Sydämen myofibrilleissä lyhyt PEVK-alue8 voi myös tukea passiivista jännitystä, mutta vain rajoitetusti (vertaa kuvan 2 legendaa). Kun PEVK-segmentin venyvyys on käytetty loppuun, passiivinen jännitys saattaa määräytyä pääasiassa Ig-domeenien2728 purkautumisen kautta; koska sydämen sarkomeerien maksimipituus ei kuitenkaan ylitä ≈2,4 μm in vivo, tällaista purkautumista ei todennäköisesti tapahdu fysiologisissa olosuhteissa.13

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että PEVK-alueen suuri venyvyys fysiologisten venytysmäärien1314 aikana viittaa siihen, että tämä domeeni pystyy purkautumaan pidennetyksi polypeptidiketjuksi. Näin ollen titiinin PEVK-alue ja tandem-Ig-domeenit saattavat muodostaa sarjassa toimivan kahden jousen järjestelmän. Molempien jousien kudosspesifinen ilmentyminen eri pituusvaihtoehdoissa voi nyt selittää, miksi raidallisten lihasten passiiviset mekaaniset ominaisuudet ovat niin erilaiset. Erilaisten tandem-Ig-segmenttien eri pituuksien ilmentyminen eri lihastyypeissä voi olla tärkeää fysiologisen löysän sarkomeerin pituuden asettamisessa, kun taas PEVK-rikkaiden sekvenssien erilainen splikointi voi kontrolloida rentoutuneelle lihaskudokselle ominaista jäykkyyttä. Tärkeä tehtävä on nyt selvittää, minkä tertiäärirakenteen avulla titiinin PEVK-alue voi tehdä massiivisia ja nopeasti palautuvia konformaatiomuutoksia, jotka pääasiassa määrittävät myofibrillaarisen passiivisen jännityksen ja kimmoisuuden.

Titiinin uudet roolit lihassolujen biologiassa

Tänään ei tiedetä, mitkä solun signaalinvälityskoneistot voivat kontrolloida jättiläismäisen titiinipolypeptidin translaatiota, kokoonpanoa sekä myös purkua ja liikevaihtoa myogeneesin ja kasvun aikana. Titiini sisältää satoja sitoutumiskohtia myosiinille, C-proteiinille ja M-linjan proteiineille715 sekä todennäköisesti huomattavalle määrälle vielä tunnistamattomia Z-levyn ja I-kaistan proteiineja. Miten lihassolu sitten kontrolloi 27 000-33 000-residisen titiinipeptidin translaatiota ja miten titiinisynteesi voidaan kytkeä tiukasti titiiniligandien kokoamiseen myogeneesin aikana? Houkutteleva malli olisi, että titiini-, myosiini- ja C-proteiinin mRNA:t ovat kolokalisoituneet ja kootranslationaalisesti koottuja,29 pakottaen näin syntyvät peptidiketjut proteiiniverkkoon, jonka parakristalliininen järjestys on havaittavissa in vivo. On selvää, että paremman ymmärryksen siitä, miten titiinin/paksujen säikeiden supramolekulaarinen kokoonpano pystyy muodostamaan erittäin järjestäytyneen kolmiulotteisen verkoston, on nyt tultava ekspressoitujen titiini-, myosiini- ja C-proteiinifragmenttien biokemiallisesta karakterisoinnista ja kenties titiinin mRNA-aineenvaihdunnan tutkimuksista.

Toinen titiinifilamentin kokoonpanoa ohjaava mekanismi saattaa viitata joihinkin titiinisekvenssin tyypillisiin piirteisiin: PEVK-alueen ja Ig- ja FN3-rakenteellisten toistojen 244-297 kopion (lihastyypistä riippuen) lisäksi titiinissä on 19 ainutlaatuista sekvenssi-insertiota, jotka yhdessä muodostavat ≈300 kD:n eli 8-10 % titiinin massasta.8 Kaksi ainutlaatuista sekvenssi-insertiota, jotka sijaitsevat titiinin N-terminaalisella ja C-terminaalisella alueella, koodaavat tandemmaisesti järjestettyjä SP-motiiveja (kuva 1). SP-toistojen seriinijäämät voidaan fosforyloida in vitro lihasuutteissa3031 , ja tämä voisi selittää, miksi titiini leimautuu nopeasti in vivo, kun eläimiin ruiskutetaan fosfaattia.32 Mahdollisesti vielä tuntemattomat fosforylaatio/defosforylaatioreitit voivat näin ollen kontrolloida titiinifilamentin kokoamista. Tulevaisuudessa olisi mielenkiintoista tutkia titiinin Z-levyn ja M-linjan päissä tapahtuvan fosforylaation toiminnallisia seurauksia.

Yksi titiinin ainutlaatuisista sekvenssi-insertioista, joka sijaitsee lähellä C-terminaalia, koodaa seriini-/treoniinikinaasidomeenia (kuva 1).7 Tämä domeeni ja sitä reunustavien Ig- ja FN3-toistojen järjestäytyminen ovat hyvin samankaltaisia kuin jättiläismäisissä selkärangattomissa valkuaisaineissa, nykäisyproteiinissa ja projektiinissa.3334 Sekä twitchinin että titiinin kinaasidomeeneissä on osoitettu olevan kalmoduliinin sitoutumiskohtia.3536 Hiljattain on osoitettu, että Aplysia-nilviäisen twitchinin kinaasi aktivoituu useita kertaluokkia ubiikkisen kalsium-reguloituvan kofaktorin S100:n avulla.37 Näin ollen vaikuttaa todennäköiseltä, että twitchin- ja kenties myös titiinifilamentit edustavat uudenlaista kalsiumherkkää filamenttijärjestelmää lihaksessa. Huolimatta kasvavasta ymmärryksestä tekijöistä, jotka kontrolloivat titiini/twitchiinikinaasien aktiivisuutta keinotekoisilla substraateilla, näiden kinaasien todellinen substraatti (ja siten niiden fysiologinen rooli) on edelleen tuntematon.

Titiinin kokoonpanon/purkamisen fysiologian ymmärtämiseksi paremmin molekyylitasolla titiinin spesifisten sitoutumiskohtien löytäminen titiinistä kalpaiiniproteaasille p94,16 saattaisi olla tärkeä edistysaskel (vrt. kuva 1). Kaikissa solutyypeissä ilmentyvistä kaikkialla esiintyvistä kalpaiineista poiketen p94 ilmentyy vain lihaskudoksissa. Käyttämällä p94:ää syöttinä hiiva-kaksoishybridiseulonnassa tunnistettiin titiinifilamentista kaksi erillistä p94:ää sitovaa paikkaa.16 Ensimmäinen paikka sijaitsee I-kaistaisen titiinin keskialueella. Mahdollisesti titiinin pilkkominen tässä kohdassa p94:n tai p94:n säätelemien proteaasien toimesta voi selittää sen, miksi titiini hajoaa helposti niin sanotuksi T2-titiiniksi (tai beta-konektiiniksi).3 Tällöin T2 saattaa olla titiinin fysiologinen hajoamistuote, joka on osallisena myofibrillaarisessa liikevaihdossa. Lisäksi titiinin toinen p94:n sitoutumiskohta sijaitsee filamentin C-terminaalisessa päässä, joka osuu yhteen titiinin viimeisen ainutlaatuisen sekvenssin insertion kanssa (kuva 1). Vaikka on epäselvää, miksi titiinissä on ainakin kaksi erillistä p94:n sitoutumiskohtaa, on mahdollista, että – koska liukoinen p94 on erittäin nopeasti hajoava ja sen puoliintumisaika on 30 minuuttia – titiinissä olevat p94:n sitoutumiskohdat voivat toimia kalpaiiniproteaasin sekventoimiseksi kompleksin avulla stabiloituun tilaan. Mielenkiintoista on, että titiinin C-terminaalinen p94:ää sitova motiivi ohitetaan joissakin lihaskudoksissa eriytyvän splikoinnin vuoksi38 , mikä lisää p94:n ja titiinin välisten vuorovaikutusten monimutkaisuutta entisestään ja tuo esiin titiinin stabiliteetin kudoskohtaisen kontrollin mahdollisuuden.

Patofysiologiset näkökohdat

Loppujen lopuksi titiinifilamentin ja p94:n tai muiden kalpaiiniproteaasien välisten vuorovaikutusten molekulaarinen ymmärtäminen voi palkita meidät perusteellisemmalla ymmärryksellä lihaksen degeneraatiosta ja regeneraatiosta, erityisesti patofysiologista tilannetta ajatellen. Normaalien ja dystrofisten potilaiden lihasbiopsioissa esiintyvien proteiinien huolellinen kartoitus osoitti titiinin hajoavan DMD:ssä ja FCMD:ssä.39 Hiljattain todettiin, että lihasspesifisen kalpaiiniproteaasin p94:n mutaatiot aiheuttavat LGMD-2A:ta40 . Koska titiini tarjoaa spesifisiä sitoutumiskohtia p94:lle,16 herää kiehtova mahdollisuus, että geneettisesti erilaisilla lihasdystrofioilla, kuten FCMD:llä, DMD:llä ja LGMD-2A:lla, on yhteistä p94:n ja titiinin vuorovaikutuksen säätelyhäiriö, joka sitten johtaa titiinifilamenttijärjestelmän patologiseen haurauteen yhteisenä, toissijaisena tautimekanismina.

Yhteenvetona todettakoon, että titiinifilamenteilla on tärkeä merkitys lihaksen fysiologisen ja patofysiologisen toiminnan kannalta. Kun A-kaistan säännöllinen titiinirakenne näyttää olevan kriittinen järjestäytyneen sarkomeerin kokoonpanon kannalta, on selvää, että I-kaistan titiinin elastisuus määrittää myofibrillin passiiviset mekaaniset ominaisuudet. Tulevaisuudessa I-kaistan titiinin elastisten ominaisuuksien parempi molekulaarinen ymmärtäminen voi perustua yhdistettyyn lähestymistapaan, jossa käytetään sekä biofysikaalisia että molekyylibiologisia tekniikoita. Mitä tulee titiinin mahdolliseen kinaasiaktiivisuuteen ja sen oletettuun rooliin signaalinsiirrossa, odotamme vielä yksityiskohtaisempaa tutkimusta. Jotta titiinin osallistumista patofysiologisiin prosesseihin voitaisiin edelleen selvittää, on tutkittava ekspressoituja titiinimoduuleja mahdollisten vuorovaikutusten löytämiseksi muiden myofibrillaaristen ja sytosolisten proteiinien kanssa, jolloin nämä vuorovaikutukset voidaan karakterisoida toiminnallisesti molekyylitasolla.

Valitut lyhenteet ja lyhenteet

Footnotes

.