Les gels protéiques standard avec une teneur en acrylamide allant de 6 à 15 % ont été couramment utilisés pour détecter les bandes de protéines dans la gamme de 10 à 200 kD. Comme cette méthode exclut la détection de protéines plus grandes, ce n’est qu’il y a deux décennies que les chercheurs ont découvert une nouvelle protéine gigantesque avec une mobilité apparente extrêmement faible en utilisant des gels non conventionnels à 2%. La masse moléculaire de cette nouvelle protéine, la titine1 (également appelée connectine2), était auparavant estimée entre 1,2 et 3,0 MD (pour des analyses, voir les références 3 et 4). Lorsque l’intensité des bandes de titine sur les gels SDS est comparée à celle des autres protéines myofibrillaires, il apparaît que la titine est, après la myosine et l’actine, la troisième protéine musculaire la plus abondante, constituant ≈10 % du contenu protéique musculaire combiné. Un adulte humain de 80 kg de poids corporel peut ainsi contenir environ un demi-kilogramme de titine. Compte tenu de son abondance, la découverte tardive de la titine est assez surprenante.
Durant les années 1980, des études de microscopie électronique avec des anticorps spécifiques de la titine avaient démontré que la titine fait partie intégrante de la myofibrille. Il a été démontré que les molécules de titine simples s’étendent du disque Z à la ligne M, formant ainsi un troisième système de filaments sarcomériques, en dehors des filaments épais (principalement la myosine) et fins (principalement l’actine).5 En conséquence, les molécules de titine natives purifiées visualisées par microscopie électronique se sont avérées avoir une longueur de >1 μm6. De plus, ces molécules sont apparues sous la forme d’une tige avec une sous-structure perlée,6 car leurs chaînes peptidiques sont principalement composées de répétitions de type Ig et FN3,7 qui se replient en domaines globulaires et représentent près de 90 % de la masse de la titine (Fig 1). Dans la bande A, ces répétitions sont disposées en motifs hautement ordonnés et aident à organiser la structure du filament épais en fournissant des sites de liaison régulièrement espacés à d’autres protéines de la bande A, notamment la méromyosine légère et la protéine C (pour une revue, voir référence 15). En raison de son association étroite avec les protéines du filament épais, la partie de la bande A de la titine est fonctionnellement rigide dans des conditions physiologiques. En revanche, la section de la bande I de la titine est élastique.517 Lorsque les filaments de titine sont extraits du sarcomère ou dégradés par des radiations ou des protéases, la rigidité de la myofibrille détendue diminue (pour une analyse, voir les références 3 et 4). Plus récemment, il a été démontré que la titine supporte la majeure partie de la tension de repos pendant les extensions physiologiques, à la fois dans les muscles squelettiques et cardiaques.1819
Les approches au niveau moléculaire pour étudier le rôle de la titine dans la structure et l’élasticité du muscle sont devenues plus faciles après la détermination de la séquence d’ADNc des titines squelettiques et cardiaques humaines.8 Comme le suggéraient précédemment les différentes mobilités des titines squelettiques et cardiaques sur les gels SDS,2021 il est maintenant clair que la titine est exprimée sous différentes isoformes dans divers tissus musculaires.8 La titine cardiaque humaine, par exemple, est codée par un ARNm géant de 82 kb, qui contient un cadre de lecture ouvert de 81 kb codant pour un peptide de 27 000 résidus (Mr, 2993 kD). En revanche, la titine du soléaire humain est un polypeptide nettement plus grand, avec une masse moléculaire de ≈3700 kD. Ces différences sont le résultat d’une série d’événements d’épissage alternatif de la titine de la bande I dans les différents tissus musculaires.8
Elasticité de la titine
Lorsque des fibres musculaires striées détendues sont étirées, il en résulte une force de rétraction, que l’on appelle tension (rigidité) passive ou de repos. On sait depuis longtemps que le muscle cardiaque est beaucoup plus rigide que le muscle squelettique. Auparavant, on pensait que la rigidité passive élevée du tissu musculaire cardiaque provenait principalement de la faible compliance des structures extracellulaires, telles que le collagène,22 mais avec l’avènement de la préparation de myocytes uniques,23 il est devenu clair que les structures rigides doivent être situées, au moins partiellement, à l’intérieur de la cellule.2425 Les éléments extracellulaires rigides, qui aident à empêcher l’étirement excessif du tissu musculaire, peuvent être trouvés seulement à des contraintes plus extrêmes. Récemment, il a également été démontré qu’une force passive significative se développe lors de l’étirement de myofibrilles isolées et détendues, les spécimens cardiaques étant environ un ordre de grandeur plus rigide que les préparations squelettiques.19 On sait maintenant que ces différences de rigidité résultent de l’expression spécifique au type de muscle de variantes de titine de longueur différente ou, plus précisément, de l’expression différentielle de deux familles de motifs de titine distincts dans la bande I (Fig 1).813 Un type de motif est représenté par des domaines Ig disposés en tandem. Le muscle strié le plus rigide des vertébrés, le cœur, exprime 40 domaines Ig en tandem, alors que le muscle soléaire, beaucoup plus souple, exprime 93 domaines Ig en tandem. L’autre segment de titine de la bande I différentiellement exprimé est un type de motif distinct appelé domaine PEVK, car les résidus proline, glutamate, valine et lysine constituent ≈70 % de sa séquence8. Ce domaine PEVK est également le plus court dans le cœur et beaucoup plus long dans le muscle squelettique : la région PEVK cardiaque humaine comprend 163 résidus, tandis que la région PEVK du soléaire humain compte ≈2200 résidus (Fig 1).8
La découverte de l’expression différentielle des régions PEVK et tandem-Ig de la titine a rendu nécessaire l’identification de la contribution relative de ces deux segments distincts de la bande I à l’élasticité des myofibrilles. Une telle identification a été récemment tentée en surveillant la position d’épitopes d’anticorps sélectionnés de la bande I de la titine dans des myofibrilles uniques étirées13 ou des fibres musculaires,14 en plus de mesurer la réponse de tension passive des spécimens (Fig 2 ; comparer avec la référence 13). Il a été suggéré qu’à une longueur de sarcomère faible, les domaines de titine de la bande I sont à l’état compact, alors qu’un petit étirement peut induire un redressement des régions tandem-Ig.13142728 Cette extension initiale est corrélée à une augmentation de la tension passive faible (muscle cardiaque) ou même négligeable (muscle squelettique) seulement202125 et ne peut donc pas être provoquée par le dépliage des modules tandem-Ig, dont il a été démontré qu’ils se replient indépendamment en domaines thermodynamiquement stables.9 Lors d’étirements modérés à longs, l’extension principale semble se produire dans la région PEVK, au moins dans les myofibrilles squelettiques,1314 alors que la tension passive augmente régulièrement (Fig 2). Dans les myofibrilles cardiaques, la courte région PEVK8 peut également soutenir la tension passive, mais seulement à un degré limité (voir la légende de la figure 2). Une fois l’extensibilité du segment PEVK épuisée, la tension passive pourrait être déterminée principalement par le dépliage des domaines Ig2728 ; cependant, comme la longueur maximale des sarcomères cardiaques ne dépasse pas ≈2,4 μm in vivo, il est peu probable qu’un tel dépliage se produise dans des conditions physiologiques.13
En conclusion, l’extensibilité élevée de la région PEVK pendant les quantités physiologiques d’étirement1314 suggère que ce domaine est capable de se démêler en une chaîne polypeptidique étendue. Par conséquent, la région PEVK de la titine et les domaines Ig en tandem pourraient constituer un système à deux ressorts agissant en série. L’expression spécifique aux tissus des deux ressorts dans des variantes de longueur différentes peut maintenant expliquer pourquoi les propriétés mécaniques passives des muscles striés sont si diverses. L’expression de différentes longueurs de segments tandem-Ig dans divers types de muscles pourrait être importante pour définir la longueur physiologique du sarcomère mou, tandis que l’épissage différentiel des séquences riches en PEVK pourrait contrôler la rigidité caractéristique d’un tissu musculaire détendu. Une tâche importante consiste maintenant à découvrir quelle structure tertiaire permet à la région PEVK de la titine de subir les changements conformationnels massifs et rapidement réversibles qui déterminent principalement la tension passive et l’élasticité myofibrillaire.
Rôles émergents de la titine dans la biologie des cellules musculaires
À l’heure actuelle, on ne sait pas quels mécanismes de transduction du signal cellulaire peuvent contrôler la traduction, l’assemblage, mais aussi le désassemblage et le renouvellement du polypeptide géant de la titine pendant la myogenèse et la croissance. La titine contient des centaines de sites de liaison pour la myosine, la protéine C et les protéines de la ligne M715 et probablement pour un nombre important de protéines du disque Z et de la bande I non encore identifiées. Comment alors la cellule musculaire contrôle-t-elle la traduction du peptide de titine de 27 000 à 33 000 résidus, et comment la synthèse de la titine peut-elle être étroitement couplée à l’assemblage des ligands de la titine au cours de la myogenèse ? Un modèle attrayant serait que les ARNm de la titine, de la myosine et de la protéine C sont colocalisés et assemblés de manière cotranslationnelle,29 forçant ainsi les chaînes peptidiques naissantes dans le maillage protéique de l’ordre paracristallin trouvé in vivo. Il est clair qu’une meilleure compréhension de la façon dont l’assemblage supramoléculaire titine/filament épais est capable de constituer un maillage tridimensionnel hautement ordonné doit maintenant provenir d’une caractérisation biochimique des fragments de titine, de myosine et de protéine C exprimés et peut-être d’études du métabolisme de l’ARNm de la titine.
Un autre mécanisme de contrôle de l’assemblage des filaments de titine pourrait être impliqué dans certains traits caractéristiques de la séquence de la titine : en plus de la région PEVK et des 244 à 297 copies de répétitions structurelles d’Ig et de FN3 (dépendant du type de muscle), la titine contient également 19 insertions de séquence uniques, qui constituent ensemble ≈300 kD, soit 8 % à 10 %, de la masse de la titine8. Deux insertions de séquence uniques, situées dans les régions N-terminale et C-terminale de la titine, codent pour des motifs SP disposés en tandem (Fig 1). Les résidus sérine dans les répétitions SP peuvent être phosphorylés in vitro par des extraits musculaires,3031 et cela pourrait expliquer pourquoi la titine devient rapidement marquée in vivo lorsque du phosphate est injecté chez les animaux.32 Il est possible que des voies de phosphorylation/déphosphorylation non encore identifiées puissent ainsi contrôler l’assemblage des filaments de titine. À l’avenir, il devrait être intéressant d’étudier les conséquences fonctionnelles de la phosphorylation aux extrémités du disque Z et de la ligne M de la titine.
L’une des insertions de séquence unique de la titine située près de l’extrémité C-terminale code pour un domaine sérine/thréonine kinase (Fig 1).7 Ce domaine et l’organisation des répétitions Ig et FN3 adjacentes sont très similaires à ceux des protéines géantes d’invertébrés, la twitchin et la projectin.3334 Dans les domaines kinases de la twitchin et de la titine, des sites de liaison à la calmoduline ont été mis en évidence.3536 Récemment, il a été démontré que la kinase de la twitchin du mollusque Aplysia est activée de plusieurs ordres de grandeur par le cofacteur ubiquitaire S100 régulé par le calcium.37 Il semble donc probable que les filaments de la twitchin, et peut-être aussi de la titine, représentent un nouveau système de filaments sensibles au calcium dans le muscle. Malgré les connaissances croissantes sur les facteurs qui contrôlent l’activité des kinases de la titine/twitchin sur des substrats artificiels, le véritable substrat de ces kinases (et donc leur rôle physiologique) reste inconnu.
Pour mieux comprendre la physiologie de l’assemblage/désassemblage de la titine au niveau moléculaire, la découverte de sites de liaison spécifiques sur la titine pour la protéase calpaïne, p94,16 pourrait être une étape importante (comparer avec la figure 1). Contrairement aux calpaïnes ubiquitaires exprimées dans tous les types de cellules, la p94 est exprimée uniquement dans les tissus musculaires. En utilisant la p94 comme appât pour un criblage de levure à deux hybrides, deux loci distincts de liaison à la p94 ont été identifiés sur le filament de titine.16 Le premier site est situé dans la région centrale de la titine de la bande I. Il est possible que le clivage de la titine par la p94 soit une étape importante. Le premier site est situé dans la région centrale de la titine de la bande I. Il est possible que le clivage de la titine sur ce site par la p94 ou par des protéases régulées par la p94 explique pourquoi la titine se dégrade facilement en titine T2 (ou bêta-connectine).3 La T2 pourrait donc être un produit de dégradation physiologique de la titine impliqué dans le renouvellement des myofibrilles. De plus, le deuxième site de liaison de la p94 sur la titine est situé à l’extrémité C-terminale du filament, coïncidant avec la dernière insertion de séquence unique de la titine (Fig 1). Bien que la raison pour laquelle au moins deux sites de liaison distincts pour la p94 sont présents dans la titine ne soit pas claire, une possibilité est que – puisque la p94 soluble est extrêmement rapidement dégradable et a une demi-vie de 30 minutes – les sites de liaison de la p94 dans la titine peuvent fonctionner pour séquestrer la protéase calpaïne dans un état stabilisé complexé. Il est intéressant de noter que le motif C-terminal de liaison à la p94 de la titine est sauté dans certains tissus musculaires par épissage différentiel,38 ce qui ajoute un niveau supplémentaire de complexité aux interactions entre la p94 et la titine et soulève la possibilité d’un contrôle spécifique au tissu de la stabilité de la titine.
Aspects pathophysiologiques
Enfin, une compréhension moléculaire des interactions entre le filament de titine et p94 ou d’autres protéases calpaïnes peut nous gratifier d’une compréhension plus approfondie de la dégénérescence et de la régénération musculaires, en particulier en ce qui concerne la situation physiopathologique. Une étude minutieuse des protéines présentes dans les biopsies musculaires de patients normaux et dystrophiques a révélé une dégradation de la titine dans la DMD et la FCMD.39 Plus récemment, on a découvert que des mutations de la calpaïne protéase p94, spécifique du muscle, provoquaient la LGMD-2A.40 Étant donné que la titine fournit des sites de liaison spécifiques pour la p94,16 la possibilité intrigante est soulevée que des dystrophies musculaires génétiquement distinctes, telles que la FCMD, la DMD et la LGMD-2A, partagent un dérèglement de l’interaction p94-titine, ce qui entraîne ensuite une fragilité pathologique du système de filaments de titine comme mécanisme commun et secondaire de la maladie.
En résumé, les filaments de titine jouent un rôle important dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique du muscle. Alors qu’une structure régulière de titine dans la bande A semble être critique pour un assemblage ordonné du sarcomère, il est clair que l’élasticité de la titine dans la bande I détermine les propriétés mécaniques passives de la myofibrille. À l’avenir, une meilleure compréhension moléculaire des propriétés élastiques de la titine de la bande I pourrait résulter d’une approche combinée, utilisant à la fois des techniques biophysiques et de biologie moléculaire. Quant à l’activité kinase potentielle de la titine et à son rôle anticipé dans la transduction du signal, nous attendons encore une exploration plus détaillée. Enfin, pour mieux découvrir l’implication de la titine dans les processus physiopathologiques, il sera nécessaire d’étudier les modules de titine exprimés pour y déceler d’éventuelles interactions avec d’autres protéines myofibrillaires et cytosoliques, et ainsi caractériser fonctionnellement ces interactions au niveau moléculaire.
Abréviations et acronymes sélectionnés
| DMD | = | Dystrophie musculaire de Duchenne |
| FCMD | = | Dystrophie musculaire congénitale de type Fukuyama-.type |
| FN3 | = | fibronectine type 3 |
| Ig | = | immunoglobuline |
| LGMD-2A | = | Dystrophie musculaire des ceintures de type 2A |
| SP | = | serine/proline dipeptide |
Figure 1. Architecture des domaines et disposition sarcomérique du filament de titine. La structure de domaine de la titine du soléus humain, telle que prédite par son ARNm de 100 kb, est représentée. Le peptide de 3,7 millions de dollars de la titine du soléus contient 297 copies de répétitions de 100 résidus, qui sont des membres des superfamilles Ig et FN3.8 Chacun de ces domaines se replie en une petite sous-unité globulaire de 10 à 12 kDa, comme l’ont montré des études structurelles.9 La microscopie immunoélectronique avec des anticorps spécifiques de la titine à épitope mappé nous permet d’estimer quels segments de la séquence codent pour le disque Z, la bande I, la bande A et la titine M-line101112. Le segment I-band de la titine est spécifique de chaînes de domaines Ig répétés en tandem (titine tandem-Ig) et du « domaine PEVK », riche en résidus proline, glutamate, valine et lysine. Le tandem-Ig et la région PEVK de la titine représentent les parties du filament de titine qui s’étendent lors d’étirements physiologiques.1314 La titine de la bande A présente des motifs réguliers de domaines Ig et FN3, appelés » super répétitions « .7 Ces super répétitions fournissent des sites de liaison multiples et structurellement ordonnés pour la myosine et la protéine C.715 Outre les répétitions Ig/FN3 et la région PEVK de la titine, 8 à 10 % de la masse de la titine sont formés par des insertions de séquences uniques. Parmi les peptides codés figurent des motifs de phosphorylation (Pi) et une sérine/thréonine kinase. Les sites de liaison p94 de la calpaïne16 sont représentés. Les flèches au-dessus du modèle de domaine indiquent les sites où se produit l’épissage alternatif spécifique au type de muscle.8 Figure 2. Modèle actuel de l’extension de la titine avec l’étirement du sarcomère. La figure montre une grande partie du demi-sarcomère, y compris la partie de la bande I, qui abrite le segment élastique de la titine. Ce modèle d’agencement de la titine reflète la situation du muscle psoas (adapté de Linke et al,13 1996) et prend également en compte la position récemment signalée de l’épitope MIR au bord même de la bande A.11 L’encart montre une courbe de longueur-tension passive typique de myofibrilles uniques du psoas,13 les lettres A à D se référant aux longueurs de sarcomère représentées dans la figure principale. On pense que lorsque la longueur est faible, les domaines de titine de la bande I sont à l’état compact (A). Lors d’un petit étirement, les domaines Ig en tandem se redressent, mais la région PEVK ne s’étend que peu, ce qui entraîne une très faible tension passive (B). Lors d’un étirement modéré, les domaines Ig s’étendent à peine plus, tandis que la région PEVK s’effiloche, ce qui entraîne une augmentation régulière de la tension passive (C). Dans les sarcomères extrêmement étirés (vers l’extrémité supérieure de la plage de longueur physiologique des sarcomères), l’élément PEVK se défait au maximum, et les domaines Ig deviennent très tendus ; la tension passive atteint alors un maximum avant que la titine de la bande A précédemment liée ne soit libérée dans la bande I (limite de déformation).20 Il convient de souligner que ce modèle proposé pour l’extension de la titine du psoas peut ne pas traiter de manière adéquate la situation du muscle cardiaque, où la contribution du segment PEVK8 court à l’extensibilité de la titine de la bande I est très faible.13 Dans les sarcomères cardiaques, une augmentation significative de la tension passive apparaît peu au-dessus de la longueur de relâchement et semble être corrélée à l’extension de la région tandem-Ig.2526 Le mécanisme précis de l’élasticité de la titine reste à élucider. Les codes couleur sont les suivants : bleu, actine ; vert, myosine ; jaune, région PEVK de la titine ; et rouge, domaines non-PEVK. Les cercles remplis représentent les modules I-band tandem-Ig. T12, N2-A, MIR et BD6 sont des sites de liaison connus des anticorps anti-titine utilisés pour mesurer les propriétés d’extension de la titine de la bande I dans des myofibrilles isolées uniques13. 9D10 ? indique la position possible de l’épitope de l’anticorps 9D10 ; les doublets de flèches en C et D indiquent que l’épitope s’est élargi à des longueurs de sarcomères plus importantes.
Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (La 668/2-3, Li 690/2-1), l’UE et le « Forschungsfond der Fakulta¨t fu¨r Klinische Medizin Mannheim ». Nous remercions J.C. Ru¨egg pour son soutien continu.
Notes de bas de page
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