APL offre servizi di analisi su gel nativo dal 1998. Oggi molti laboratori purtroppo ignorano questo prezioso strumento perché pensano che i gel nativi siano troppo difficili da usare, o perché credono erroneamente che possano essere usati solo con proteine acide. In Alliance Protein Laboratories eseguiamo abitualmente gel nativi su proteine sia basiche che acide. Saremo lieti di eseguire campioni per voi e/o lavorare con voi per sviluppare un protocollo da utilizzare nel vostro laboratorio.
Cos’è un gel nativo?
L’elettroforesi su gel “nativo” o “non denaturante” viene eseguita in assenza di SDS. Mentre nella SDS-PAGE la mobilità elettroforetica delle proteine dipende principalmente dalla loro massa molecolare, nella PAGE nativa la mobilità dipende sia dalla carica della proteina che dalla sua dimensione idrodinamica.
La carica elettrica che guida l’elettroforesi è governata dalla carica intrinseca della proteina al pH del tampone di esecuzione. Questa carica dipenderà, ovviamente, dalla composizione amminoacidica della proteina e dalle modifiche post-traslazionali come l’aggiunta di acidi sialici.
Poiché la proteina mantiene la sua conformazione ripiegata, la sua dimensione idrodinamica e la mobilità sul gel varieranno anche con la natura di questa conformazione (maggiore mobilità per conformazioni più compatte, minore per strutture più grandi come gli oligomeri). Se la PAGE nativa viene effettuata vicino al pH neutro per evitare la denaturazione acida o alcalina, allora può essere usata per studiare la conformazione, l’autoassociazione o l’aggregazione e il legame di altre proteine o composti.
Quindi i gel nativi possono essere sensibili a qualsiasi processo che altera la carica o la conformazione di una proteina. Questo li rende strumenti eccellenti per rilevare cose come:
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cambiamenti di carica dovuti alla degradazione chimica (es. deamidazione)
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svolgimento, “globulo fuso”, o altre conformazioni modificate
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oligomeri e aggregati (sia covalenti che non covalenti)
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eventi di legame (proteine-proteine o proteine-ligando)
Queste proprietà, e il loro rendimento relativamente alto, rendono i gel nativi strumenti eccellenti per analizzare campioni di stabilità accelerata, dimostrare la comparabilità di diversi lotti o processi, o esaminare gli effetti degli eccipienti.
Un altro vantaggio dei gel nativi è che è possibile recuperare le proteine nel loro stato nativo dopo la separazione. Il recupero di materiali biologici attivi può, tuttavia, avere bisogno di essere fatto prima di qualsiasi fissaggio o colorazione.
Nota che i gel nativi qui discussi sono a volte chiamati gel “nativi chiari”. Essi differiscono in linea di principio dai cosiddetti gel “nativi blu”, che dipendono dal legame del colorante per dare alla proteina una carica elettrica molto alta, che supera la carica intrinseca del polipeptide. Se si suppone che la quantità di colorante legato sia proporzionale alla massa della proteina, allora la mobilità osservata usando questo protocollo “blu nativo” può essere usata per stimare la massa molare confrontandola con gli standard proteici, proprio come si fa per la SDS-PAGE. Gli standard di massa venduti per l’uso con i gel nativi blu non possono essere utilizzati per stimare le masse molari per i veri gel nativi che vengono discussi qui.