Il saggio di migrazione Transwell è una tecnica classica che permette agli scienziati di quantificare il movimento delle cellule. La migrazione si riferisce alla capacità di una cellula di muoversi individualmente o in gruppi. I movimenti delle cellule sono resi possibili attraverso una precisa ristrutturazione del loro citoscheletro e la migrazione di solito avviene in risposta a stimoli che agiscono come spunti.
Oggi, discuteremo il saggio di migrazione transwell, che utilizza una semplice configurazione della camera per valutare la migrazione in risposta a spunti di attrazione.
Iniziamo fornendo alcune informazioni di base sulla camera transwell.
L’apparato è stato progettato dal Dr. Stephen Boyden nel 1961, che lo ha utilizzato per studiare la migrazione dei leucociti. Pertanto, questo metodo è anche conosciuto come il saggio della camera di Boyden.
In una semplice camera di Boyden, la parete esterna è dei pozzetti, come quelli di una piastra a 96 pozzetti. All’interno di ogni pozzetto, viene posto un transwell, che è un inserto cilindrico. L’inserto ha una membrana in policarbonato con una dimensione definita dei pori. Quando è posizionato nel pozzetto, divide la camera in due compartimenti. Il compartimento superiore è dove le cellule il cui comportamento migratorio deve essere studiato saranno seminate, e il serbatoio inferiore è dove la soluzione di chemoattrattore è posto. Per definizione, un chemioattrattore è una molecola che ha la capacità di promuovere la motilità cellulare “attirando le cellule”
A causa di queste forze attrattive, le cellule nel compartimento superiore migrano attraverso i pori nel serbatoio inferiore. Se le cellule hanno proprietà aderenti, come alcune cellule di melanoma, in seguito al movimento si “attaccheranno” al lato inferiore della membrana. In questo caso, la membrana può essere fissata, colorata e le cellule possono essere contate al microscopio. D’altra parte, le cellule non aderenti, come lo sperma, migreranno nel serbatoio inferiore. In questo caso, le cellule nella soluzione del serbatoio possono essere contate con l’aiuto di un emocitometro.
Anche se la configurazione per questo test è semplice, ci sono diverse cose che è necessario considerare prima dell’esperimento. Rivediamone alcune.
Partendo dalla soluzione di semina, dovete assicurarvi che la densità sia ottimizzata per osservare la migrazione cellulare. Troppe poche cellule possono risultare in una migrazione non rilevabile, e densità maggiori sovraffolleranno la membrana, rendendo difficile enumerare la migrazione. La seconda considerazione è la dimensione dei pori dell’inserto. Dovrebbe essere scelta attentamente in base al tipo di cellula. Se la dimensione dei pori è troppo piccola, le cellule non saranno in grado di passare.
In alternativa, se la dimensione dei pori è troppo grande, le cellule cadranno attraverso, che non è la migrazione. Infine, bisogna fare attenzione alla concentrazione del chemioattrattore e al tempo di incubazione da concedere per la migrazione, perché sono interdipendenti. Una concentrazione ottimale con un tempo di incubazione appropriato durante il quale viene mantenuto il gradiente di concentrazione tra i compartimenti, induce la migrazione delle cellule a causa della chemioattrazione. Al contrario, incubazioni prolungate possono essere accompagnate da un equilibrio del chemioattrattore in tutta la camera che porta alla perdita del gradiente chimico, che può confondere l’analisi dei risultati ottenuti.
Con queste considerazioni in mente, discutiamo un protocollo utilizzato per misurare la migrazione delle cellule aderenti.
Le cellule da testare sono preparate in un mezzo privo di proteasi, poiché le proteasi possono denaturare importanti recettori di membrana, e in definitiva influenzare la migrazione. Dopo che le cellule sono state preparate, la sospensione dovrebbe essere diluita ad una densità di semina ottimale. Per preparare la camera, i transwells sono posti in pozzetti su una piastra multiwell. La sospensione cellulare deve essere pipettata nel transwell senza toccare la membrana o introdurre bolle d’aria.
La soluzione chemioattrattiva viene pipettata nel serbatoio inferiore, assicurandosi che la soluzione tocchi la membrana dell’inserto. Il tempo di incubazione per la migrazione dipenderà dalle considerazioni sperimentali. Dopo l’incubazione, le membrane sono fissate immergendo l’inserto in etanolo al 70%. Dopo aver lasciato asciugare l’inserto, viene aggiunta la soluzione di colorazione delle cellule.
In seguito, le cellule vengono incubate per circa 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, gli inserti vengono lavati con l’aiuto del tampone di lavaggio. Infine, la membrana può essere escissa e posta su un vetrino da microscopio. Le cellule sul lato inferiore della membrana rappresentano il numero di cellule che sono migrate in presenza e in assenza dei chemioattrattori.
Siccome, ora avete un’idea del protocollo, diamo un breve sguardo a come i ricercatori stanno usando questo metodo nelle loro esplorazioni.
Una delle applicazioni più comuni di questo saggio è quella di valutare le proprietà chemioattrattive di composti sconosciuti. In questo caso, gli scienziati erano interessati ad esaminare i percorsi di nuoto degli spermatozoi di rana in presenza di allurina, che è una sostanza secreta dalle uova degli anfibi. Per fare questo, hanno prima pipettato spermatozoi di rana attivi nella parte superiore degli inserti transwell. Sul fondo, hanno aggiunto l’allurina. Dopo aver permesso alle cellule di migrare, hanno contato gli spermatozoi nella soluzione serbatoio sotto un microscopio. Usando questa tecnica, sono stati in grado di generare una curva concentrazione-risposta che rappresenta l’effetto della concentrazione di allurina sulla migrazione degli spermatozoi.
Quando una cellula viene attaccata da agenti patogeni, invia chemoattrattanti per reclutare cellule immunitarie che migrano, si attaccano e successivamente risolvono l’infezione. Per testare questo fenomeno, questi scienziati hanno coltivato cellule epiteliali sul lato inferiore degli inserti. Successivamente, hanno infettato queste cellule con diversi ceppi di batteri. Infine, hanno introdotto cellule immunitarie nella camera superiore. È noto che le cellule infettate producono diversi chemioattrattori che inducono la migrazione delle cellule immunitarie. I risultati di questo esperimento hanno dimostrato diversi gradi di migrazione dei neutrofili in risposta a diversi tipi di infezione batterica.
Infine, l’invasione delle cellule tumorali e la metastasi attraverso la matrice extracellulare ha sempre incuriosito i biologi cellulari. Qui, gli scienziati hanno voluto determinare come specifici chemoattrattori possono contribuire a tale migrazione attraverso una matrice 3D. Hanno ingegnerizzato geneticamente due gruppi separati di cellule: uno che esprimeva una proteina fluorescente verde e un altro rosso fluorescente. Hanno poi pipettato una matrice extracellulare-mimetica nella parte superiore del transwells.
Una volta solidificato, hanno invertito il transwell e seminato due pool di cellule sul lato inferiore della membrana. Successivamente, hanno sostituito l’inserto nella piastra multiwell e hanno pipettato la soluzione chemioattrattiva nella camera superiore. Questo ha fatto sì che le cellule sul fondo si muovessero verso l’alto e attraverso la matrice 3D. Con l’aiuto dell’imaging confocale, questi ricercatori hanno ricostruito la migrazione cellulare in 3D, e hanno distinto i modelli di migrazione di due gruppi di cellule.
Hai appena visto il video di JoVE sul test di migrazione transwell. Con la comprensione dei componenti e del protocollo di questo metodo, ora sai perché è così ampiamente utilizzato dai biologi cellulari. Nonostante la semplicità di questo setup, la gamma di configurazioni che questo metodo può adattare lo rende indispensabile per gli studi di motilità cellulare. Come sempre, grazie per aver guardato!