Soggetti
Questo studio ha coinvolto 88 pazienti con LC non trattati senza metastasi a distanza. Tutti i pazienti sono stati diagnosticati con carcinoma a cellule squamose della laringe mediante esame patologico dei campioni e sono stati trattati presso il Dipartimento di Otorinolaringoiatria, Chirurgia della testa e del collo, Università delle Ryukyus, tra gennaio 2008 e dicembre 2017. La prognosi finale dei pazienti è stata giudicata nel luglio 2018. La classificazione dello stadio del tumore, dei linfonodi e delle metastasi (TNM) è stata effettuata secondo l’AJCC Staging Manual (7a edizione). Per determinare lo stadio clinico e per individuare tumori primari multipli concomitanti, i pazienti sono stati sottoposti a esami fisici ed endoscopici del tratto gastrointestinale superiore, ispezione ultrasonica del collo, tomografia computerizzata (TC) e tomografia a emissione di positroni 18F-fluorodeossiglucosio.
Questo studio è stato approvato dall’Institutional Review Board dell’Università delle Ryukyus ed è stato condotto in conformità alla Dichiarazione di Helsinki del 1975, rivista nel 2008. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti con LC prima dell’arruolamento.
Trattamento
Il trattamento principale per la lesione primaria con intento curativo è stato la radioterapia convenzionale (RT) da sola o la resezione laser in T1, la chemioradioterapia concomitante (CCRT) in T2, CCRT o chirurgia in T3, e chirurgia in T4, indipendentemente dalla presenza di HPV. Le lesioni nodali sono state gestite con CCRT o dissezione del collo combinata con la resezione della lesione primaria. Tutti i pazienti che hanno ricevuto la radioterapia (dose totale, 70 Gy) hanno avuto una pianificazione tridimensionale del trattamento con radioterapia assistita da TC nella posizione di trattamento con immobilizzazione della maschera. Il protocollo per la CCRT era quello riportato in precedenza. Quando il tumore primario in T3 non ha mostrato una risposta parziale indipendentemente dalla risposta dei linfonodi del collo a 39,6 Gy di irradiazione, i pazienti sono stati sottoposti a chirurgia curativa per la lesione primaria combinata con la dissezione del collo.
Rilevazione dello stato di HPV e immunoistochimica di p16
Tutti i campioni di tessuto da lesioni primarie senza alcuna radiazione o chemioterapia sono stati analizzati con la reazione a catena della polimerasi (PCR) per la rilevazione del DNA di HPV utilizzando campioni freschi congelati, che sono stati ottenuti alla biopsia o alla resezione chirurgica, e immunoistochimica di p16 utilizzando campioni FFPE. I casi con risultati negativi alla rilevazione dell’HPV sulla PCR e sovraespressione di p16 (≥75% di cellule positive e intensità di colorazione almeno moderata) sono stati ulteriormente valutati per lo stato dell’HPV utilizzando l’ibridazione in situ (ISH) con sonde di DNA HPV (DNA ISH). La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per la carica virale e lo stato fisico, come descritto di seguito, è stata effettuata nei casi che ospitavano HPV-16.
PCR per il rilevamento del DNA HPV
In breve, il DNA è stato isolato dai campioni di tumore utilizzando un kit Gentra Puregene Tissue (QIAGEN, Germantown, MD). La presenza e l’integrità del DNA sono state verificate in tutti i campioni mediante amplificazione PCR del gene della β-globina utilizzando i primer PC04 e GH20 . I set di primer di consenso generale GP5+/GP6+ e MY09/MY11 sono stati utilizzati per analizzare la presenza di HPV DNA mediante PCR (Tabella 1) come descritto in precedenza. Inoltre, i campioni di DNA negativi per GP5+/GP6+ o MY09/MY11 PCR sono stati amplificati nuovamente utilizzando un approccio PCR annidato con la coppia di primer GP5+/GP6+. I prodotti di PCR della dimensione prevista (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) sono stati purificati e sequenziati direttamente con un analizzatore genetico ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Le sequenze sono state allineate e confrontate usando il programma BLAST con quelle di tipi noti di HPV nel database GenBank.
Immunoistochimica p16
L’immunoistochimica per p16 è stata eseguita usando un kit istologico CINTec® p16 (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Germania) secondo il protocollo del produttore. L’immunomarcatura è stata visualizzata mediante incubazione in 3,3′-diaminobenzidina e i vetrini colorati sono stati controcolorati con ematossilina.
I criteri di punteggio per l’immunoreattività della p16 utilizzati nel presente studio sono stati i seguenti: 0, nessuna colorazione; 1, 1 – < 25% delle cellule tumorali positive per p16; 2, 25 – < 50% positivo; 3, 50 – < 75% positivo; 4, ≥75% positivo e debole intensità di colorazione; e 5, ≥75% positivo e almeno moderata intensità di colorazione. Il termine “sovraespressione di p16” (p16-positivo) è stato definito come un punteggio di 5 nel presente studio.
ISH con sonde HPV DNA
L’ISH basato sulla biotiniltiramide è stato eseguito utilizzando la sonda GenPoint™ HPV DNA biotinilato e il sistema di amplificazione del segnale GenPoint tiramide per sonde biotinilate secondo il protocollo del produttore (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). La sonda GenPoint HPV DNA biotinilato reagisce con i tipi di HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 in sezioni di 4μm di spessore di campioni FFPE. Il rilevamento della sonda ibridata è stato eseguito utilizzando il sistema di rilevamento GenPoint secondo il protocollo del produttore, con la streptavidina-perossidasi di rafano (HRP) primaria inclusa, la tiramide biotinile, la streptavidina-HRP secondaria e la 3,3′-diaminobenzidina l (Dako; Agilent Technologies). I vetrini sono stati controcolorati con ematossilina.
Stima della carica virale e dello stato fisico di HPV-16 mediante qPCR
Per valutare la carica virale e lo stato fisico di HPV-16, la qPCR è stata eseguita come descritto in precedenza. In breve, sono stati utilizzati primer e sonde TaqMan che hanno come obiettivo le cornici di lettura aperte di HPV-16 E2 ed E6 (Tabella 1). I primer e le sonde riconoscono la regione della cerniera E2, che viene eliminata nell’integrazione dell’HPV-16. Due curve standard per i geni E2 ed E6 sono state create dall’amplificazione di diluizioni seriali di 10 volte (101, 102, 103, 104, 105, e 106 copie virali) del plasmide pB-actin early, che era un regalo di Karl Munger, che porta la regione completa del gene HPV-16 early (plasmide Addgene # 13711; Addgene, Cambridge, MA). La carica di DNA virale è stata valutata calcolando il numero di copie E6. Una curva standard esterna è stata creata utilizzando diluizioni seriali note (0,3, 3, 30 e 300 ng) di DNA genomico placentare umano (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania) per la quantificazione del DNA cellulare, e la β-globina è stata amplificata come descritto precedentemente. La quantità di DNA è stata calcolata tracciando i valori Cq contro il logaritmo della curva standard. Lo stato fisico di HPV-16 è stato valutato sulla base di un metodo precedentemente pubblicato. Un rapporto E2/E6 ≥ 1 indica la predominanza della forma episomale, mentre un rapporto numero di copie E2/totale E6 < 1 indica la presenza di entrambe le forme integrate ed episomali (forma mista).
Rilevamento dell’espressione dell’mRNA E6 mediante qPCR e RNA ISH in pazienti HPV-16-positivi con sovraespressione di p16
L’espressione dell’mRNA E6 è stata rilevata in campioni di pazienti identificati come HPV-16-positivi con sovraespressione di p16. L’RNA totale è stato estratto da tessuti congelati usando RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. L’RNA totale (500 ng) è stato usato per sintetizzare il primo filamento di cDNA usando un kit PrimeScript™ RT Reagent con gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) secondo le istruzioni del produttore. Per misurare l’espressione dell’mRNA di HPV-16 E6, è stata eseguita la qPCR utilizzando il sistema di rilevamento CFX96 Touch™ Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) e TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Sono stati utilizzati primer e sonde TaqMan (Tabella 1) che hanno come target il gene HPV-16 E6 e il gene della β-actina. La sonda β-actina è stata marcata con FAM all’estremità 5′ e con TAMRA all’estremità 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Giappone). Le condizioni di amplificazione erano: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, e un ciclo a 2 fasi di 95 °C per 15 s e 60 °C per 60 s per un totale di 40 cicli. Due curve standard sono state generate per i geni E6 e β-actina mediante amplificazione di diluizioni seriali 10 volte (101, 102, 103, 104, 105, e 106 copie) del plasmide pB-actin early e il plasmide pCAG-mGFP-actin, che era un dono di Ryohei Yasuda, portando la regione codificante completa di β-actin (Addgene plasmide # 21948; Addgene). L’espressione del gene E6 in ogni campione è stato normalizzato dalla quantità del controllo interno β-actina.
RNA ISH per HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA è stato eseguito utilizzando un RNAscope ® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) secondo le istruzioni del produttore. In breve, sezioni seriali spesse 4μm di campioni FFPE sono state deparaffinate in xilene e reidratate utilizzando una serie graduata di alcool. La perossidasi endogena è stata bloccata con il RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent a temperatura ambiente per 10 minuti. Il recupero dell’RNA target dell’HPV è stato eseguito in RNAscope® Target Retrieval Reagent a 100 °C per 15 min. I vetrini sono stati digeriti con RNAscope® Protease Plus a 40 °C per 30 min. La sonda RNA HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) è stata aggiunta alle sezioni ed è stato applicato un coprivetrino. I vetrini sono stati trasferiti in una camera umidificata per l’ibridazione a 40 °C per 2 ore. Quindi, i coprioggetti sono stati rimossi e i vetrini sono stati lavati con RNAscope® Wash Buffer Reagent a 40 °C. L’amplificazione del segnale è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. Il rilevamento della sonda ibridata è stato eseguito utilizzando 3,3′-diaminobenzidina (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). I vetrini sono stati controcolorati con ematossilina. I vetrini di controllo positivo (cellule HeLa che esprimono mRNA di HPV-18 E6/E7) sono stati inclusi nell’RNA ISH. La colorazione positiva è stata identificata come puntini marroni visti nel nucleo e/o nel citoplasma.
Analisi statistica
Il test chi-quadrato di Pearson è stato utilizzato per confrontare le caratteristiche dei pazienti con LC in base allo stato di HPV DNA e sovraespressione di p16. La sopravvivenza cumulativa (CS) è stata calcolata utilizzando il metodo Kaplan-Meier ed è stata confrontata tra due gruppi utilizzando il test log-rank. Tutte le analisi sono state eseguite con il pacchetto statistico SPSS (SPSS, versione 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 è stato considerato significativo.