L’osservazione che l’immunoneutralizzazione della somatostatina ha aumentato il volume basale e la produzione di amilasi in un modello di pancreas isolato di ratto, suggerisce una fonte intrapancreatica di somatostatina. Questa somatostatina pancreatica potrebbe quindi causare un’inibizione tonica della secrezione pancreatica esocrina (97). In ratti coscienti con secrezioni biliari e pancreatiche restituite all’intestino, la somatostatina iv (5 µg kg-1 h-1) ha inibito la secrezione pancreatica basale di proteine e fluidi dell’84 e 64%, rispettivamente; l’aggiunta di atropina ip (500 µg kg-1 h-1) non ha causato ulteriore inibizione (51). Nei ratti anestetizzati, la secrezione basale di amilasi è stata significativamente inibita da un’infusione di somatostatina a una dose relativamente alta di 100 µg 100 g-1 h-1. Tuttavia, quando è stata somministrata come iniezione in bolo di 50 µg 100 g-1 BW, il rilascio di amilasi è aumentato di quattro volte per 20 minuti (39). In uno studio precedente (25), la somatostatina somministrata a dosi da 0,4 a 25 µg kg-1 h-1 a ratti fistola coscienti ha provocato diminuzioni dose-dipendenti del flusso basale, del bicarbonato e del rilascio di proteine. Alle dosi più alte, il rilascio di proteine è stato ridotto dell’80%, il bicarbonato del 63% e il flusso del 42%. Nei ratti anestetizzati con uretano, è stato osservato un aumento iniziale di tutti i parametri pancreatici nei primi due minuti, seguito da una diminuzione dal 30 al 40% della produzione di proteine. In tali condizioni, la somatostatina doveva raggiungere la dose di 100 µg kg-1 h-1 per influenzare il rilascio basale di bicarbonato. Questi dati sulla secrezione pancreatica basale di liquidi e proteine indicano che l’effetto inibitorio della somatostatina sembra specifico della specie e sensibile all’anestesia, come precedentemente dimostrato (17). Quando i ratti sono stati infusi intraduodenalmente con SS-14 a dosi da 12 a 96 µg kg-1 h-1, il volume totale basale e la produzione di proteine non sono stati influenzati; questi risultati potrebbero indicare che la somatostatina duodenale luminosa non influenza la secrezione pancreatica basale direttamente o attraverso il rilascio basale di CCK e secretina (126). Contrariamente al ratto, l’infusione iv di SS-28 a 400 ng kg-1 h-1 ha totalmente inibito la secrezione basale di liquidi e proteine nel cane cosciente (147). Anche in cani preparati con fistole gastriche e pancreatiche, la somatostatina-14 a 2,5 µg kg-1 h-1 ha inibito la secrezione basale di volume e proteine di oltre il 90% (146).
Nell’uomo, la stimolazione pancreatica mediante somministrazione intraduodenale di triptofano o una miscela di aminoacidi è stata attenuata dalla SS-28 esogena (58). In altri studi sull’uomo, l’octreotide ha inibito la secrezione enzimatica pancreatica postprandiale (81). Nel cane, l’SS-14 somministrato come bolo iv a 3,5 µg kg-1 seguito da infusione a 3,5 µg kg-1 h-1 ha causato riduzioni significative delle attività duodenali di tripsina e amilasi durante la stimolazione di un pasto di prova (70). Nel ratto, l’octreotide ha inibito significativamente il volume pancreatico, il bicarbonato, l’amilasi e i livelli sierici di secretina e CCK in risposta all’acido oleico intraduodenale, un rilasciatore di CCK (137).
In volontari sani (30), il succo pancreatico puro è stato ottenuto mediante incannulazione endoscopica del condotto pancreatico principale. In risposta alla secretina sintetica (0,06 CU kg-1 h-1), la concentrazione di bicarbonato nel succo pancreatico ha raggiunto livelli di 117 µEq ml-1 dopo 10 min e un flusso di succo di 7,3 ml/5 min dopo 15 min di infusione di secretina. La SS-14 ha portato a una diminuzione del 47% del flusso pancreatico dopo 10 min e del 67% dopo 15 min. Le concentrazioni di bicarbonato e proteine nel succo pancreatico hanno mostrato solo una tendenza a diminuire alla dose di somatostatina di 5 µg kg-1 h-1. Anche nell’uomo, la secrezione enzimatica pancreatica, ma non quella di bicarbonato, stimolata dalla secretina (250 ng kg-1/20 min) e dalla caeruleina (25 ng kg-1/20 min) era inibita dalla SMS 201-995 in modo indipendente dalla dose (73). In cani coscienti (147), la secrezione di fluido e bicarbonato stimolata dalla secretina (1 CU kg-1 h-1) è stata leggermente influenzata da dosi maggiori di SS-28 (400 ng kg-1 h-1). Alla stessa dose, la produzione di proteine stimolata dalla caeruleina è stata significativamente inibita. In ratti anestetizzati, la somatostatina-14 lineare somministrata a 100 µg/100 g-1 h-1 ha causato una forte inibizione dei rilasci di amilasi e tripsina pancreatica stimolati da 3 unità di cane IVY/100 g-1 h-1 di CCK con un rapido rimbalzo di queste secrezioni una volta che l’infusione di somatostatina era terminata (39). In ratti coscienti con deviazione del succo pancreatico (51) che ha causato forti aumenti delle secrezioni di proteine e fluidi, tutte e cinque le dosi di octreotide infuse (5,20,80,320 e 1280 ng kg-1 h-1) hanno inibito significativamente la secrezione di proteine e fluidi con IC50 di 40 e 60 ng kg-1 h-1, rispettivamente. L’inibizione massima di proteine e fluidi ha raggiunto rispettivamente il 90% e il 75% alla dose di 1,28 µg kg-1 h-1. SS-14 rispetto al suo analogo octreotide aveva un IC50 di 0,7 µg kg-1 h-1 per la secrezione proteica e 1,2 µg kg-1 h-1 per la secrezione fluida, con un effetto inibitorio massimo ottenuto a 25 µg kg-1 h-1 sia per la secrezione proteica che per quella fluida. Questi dati indicano che l’octreotide è 20 volte più potente dell’SS-14 nell’inibire la secrezione pancreatica di proteine e volume stimolata dalla deviazione del succo pancreatico.
Studi in vitro
La secrezione pancreatica di enzimi e fluidi in vivo è la somma di numerosi processi fisiologici complessi che includono l’interazione di ormoni endocrini e paracrini, nonché la stimolazione e il rilascio di neurotrasmettitori. A causa di queste interazioni multiple, è spesso difficile valutare se un composto che inibisce la secrezione pancreatica in vivo colpisce direttamente le funzioni delle cellule acinari e duttali o altera il rilascio di secretagoghi. Pertanto, il pancreas isolato perfuso, le preparazioni cellulari acinari e duttali isolate e le colture cellulari di entrambi i tipi di cellule possono dare risposte ad alcune di queste domande.
Le cellule acinari pancreatiche di ratto possiedono recettori specifici per la somatostatina-14 e 28 (124,166) che rimangono presenti dopo le preparazioni cellulari (40). È stato anche riportato che nel pancreas di cane perfuso isolato, la ghiandola può assorbire fino al 50-80% della somatostatina perfusa in un intervallo di concentrazione da 20 a 4000 pg ml-1 rispetto a meno del 21% di insulina o glucagone (71). Questa osservazione è stata successivamente confermata con l’estrazione di SS-14 dal pancreas di cane in situ con una media superiore al 50% rispetto a meno del 17% per il glucagone (152). Tutte queste osservazioni ci lasciano credere che la somatostatina dovrebbe essere in grado di inibire direttamente la secrezione enzimatica pancreatica stimolata a livello neurale o ormonale in vitro utilizzando le preparazioni cellulari sopra citate.
Nonostante i numerosi studi, l’effetto inibitorio della SS-14 e della SS-28 sul rilascio enzimatico stimolato dagli acini pancreatici isolati è ancora controverso. Per comprendere alcuni di questi risultati opposti, può aiutare a fare una distinzione tra effetto di SS sulla stimolazione in cui l’agonista come VIP funziona attraverso cAMP, dove la SS inibisce e agonisti come CCK dove alcuni ricercatori hanno osservato un effetto inibitorio e altri no. In acini perfusi di cavia, il profilo cinetico del rilascio di amilasi in risposta al VIP è stato significativamente diminuito dalla SS (100 nM) (140). D’altra parte, l’octreotide (100 nM) ha inibito significativamente il rilascio sinergico di amilasi stimolato da secretina + CCK-8 o da VIP + CCK-8 (65). La somatostatina ha anche inibito l’effetto del cAMP sulla secrezione di amilasi indotta dal calcio dagli acini pancreatici di ratto spostando la curva dose-risposta a destra (99), un altro esempio di SS che agisce attraverso la via del cAMP.
Molti altri studi però dimostrano chiaramente che la somatostatina non ha effetti inibitori sul pancreas esocrino in vitro, sia sul pancreas isolato perfuso, sia sugli acini isolati o sulle preparazioni di lobuli isolati in cui la CCK era lo stimolo (65,96,99,139,158). Nel pancreas isolato di ratto (43), l’insulina esogena (10 mU ml-1) ha potenziato significativamente la CCK e la secrezione di amilasi stimolata dal carbacholo, un potenziamento significativamente inibito dalla SS. La mancanza di un effetto inibitorio diretto di SS è stata osservata anche in cellule parietali canine isolate (106). Infatti, SS a 1 µM non è riuscito a inibire la risposta secretoria gastrica all’istamina, alla metacolina e alla pentagastrina, supportando alcuni dei dati sopra menzionati. È interessante notare che SS-28 all’alta concentrazione di 10 µM è stato in grado di stimolare il rilascio di amilasi dagli acini del pancreas della cavia a circa il 68% di quello stimolato da 100 pM di caeruleina. Una risposta secretoria massima identica a quella iniziata dalla caeruleina è stata ottenuta anche da due analoghi della SS-28, Nat S1-28 e SS28. In queste condizioni, SS-14 non ha avuto alcun effetto stimolatorio (33). Come spiegazione di questo effetto secretorio della SS-28 sugli acini, è stato proposto che la SS-28 può interagire con il recettore CCK ad alte concentrazioni (34), un effetto inibito dal DBcGMP, un antagonista del recettore CCK (105). D’altra parte, l’incapacità dell’SS-14 di inibire la secrezione enzimatica stimolata dagli acini isolati può risultare nel rilascio nel mezzo di incubazione di una proteasi attiva, osservata per la prima volta nel succo pancreatico secreto, e capace di degradare l’SS-14 (127). Questa proteasi serinica è stata purificata fino all’omogeneità dal succo pancreatico puro di ratto. Con un MW di circa 29 kDa, corrisponde all’elastasi II pancreatica di ratto. Pertanto, se secreta nel mezzo di incubazione, degraderebbe la SS-14 e impedirebbe qualsiasi suo effetto inibitorio e quindi spiegherebbe in parte perché la SS-14 non è stata in grado di mostrare i suoi effetti inibitori sul rilascio dell’enzima in vitro (151). Potrebbe anche influenzare la risposta secretoria all’SS-28 a concentrazioni più basse nel mezzo di incubazione. Un’altra possibilità potrebbe essere che gli agenti calcificanti delle cellule diminuiscano l’affinità dei recettori della somatostatina delle cellule acinari per la somatostatina (33).
Effetti sulla crescita
La crescita normale di un organismo deriva da un complesso equilibrio degli ormoni coinvolti, come l’ormone della crescita, l’insulina e gli ormoni tiroidei. Poiché la somatostatina può inibire il rilascio di molti ormoni, la sua neutralizzazione dovrebbe stimolare la loro secrezione e quindi aumentare la crescita. Questo approccio di auto-immunizzazione contro la somatostatina per stimolare la crescita è stato testato negli agnelli. Quando sono stati ottenuti titoli anticorpali significativi, il tasso di aumento del peso era maggiore negli animali immunizzati SS e accompagnato da un aumento dell’altezza. In questi agnelli immunizzati, c’era una maggiore risposta dell’ormone della crescita alla stimolazione dell’arginina così come livelli ematici basali più alti di somatomedina (143). Questi dati sono stati successivamente confermati anche in questa specie (75). Quando è stata somministrata a ratti impiantati per via sottocutanea con una mini-pompa Alzet, la somatostatina somministrata a 1,5 µg h-1 per 14 giorni non ha avuto alcun effetto sull’aumento di peso. Tuttavia, l’infusione di un antagonista della somatostatina ha portato a un aumento significativo dell’aumento di peso rispetto al controllo (144).
Nel ratto, l’iniezione quotidiana di somatostatina-14 a 390 µg kg-1 giorno-1 in gelatina per tre settimane non ha avuto effetti sul peso corporeo ma ha abbassato la densità delle cellule parietali e peptiche per millimetro cubo rispetto ai controlli. Tuttavia, ha antagonizzato l’effetto di promozione della crescita del rilascio di gastrina esogena (130 µg kg-1 giorno-1) ed endogena dopo la trasposizione dell’antrum sul colon, causando ipergastrinemia. In questi animali traslocati nell’antro, l’aumento del peso pancreatico è stato significativamente ridotto dalla somatostatina (400 µg kg-1 giorno-1) per 3 settimane (80). Per un periodo di 5 giorni, la somatostatina-14 s.c. in gelatina a dosi di 11, 33 o 100 µg kg-1 ogni 8 ore ha causato diminuzioni significative delle concentrazioni pancreatiche di amilasi, chimotripsina e proteine e del contenuto totale di DNA solo alle due dosi più alte senza alcun effetto sul peso pancreatico totale. Tuttavia, i tassi di sintesi di proteine, RNA e DNA sono stati significativamente ridotti immediatamente dopo ogni iniezione di somatostatina per 24 ore (92). La somatostatina-14, anch’essa somministrata s.c. in gelatina alla dose di 600 µg kg-1, tre volte al giorno per 2 e 4 giorni, ha ridotto significativamente gli effetti trofici della caeruleina (1 µg kg-1, tre volte al giorno) con un forte effetto sul contenuto totale di DNA. È interessante notare che l’immunoneutralizzazione contro SS-14 ha aumentato significativamente tutti i parametri di crescita studiati al di sopra di quelli osservati in risposta alla caeruleina (93). Effetti inibitori simili sono stati osservati con la somministrazione prolungata di somatostatina a lunga durata d’azione, SMS 201-995 (54). La diversione del succo pancreatico nel ratto provoca un significativo rilascio di CCK endogena con conseguente aumento della crescita pancreatica (89). Utilizzando questa procedura di diversione del succo biliare-pancreatico, tale tecnica applicata 8 h giorno-1 per 4 giorni ha portato ad aumenti significativi del peso pancreatico e della CCK nel siero; entrambi gli effetti sono stati significativamente ridotti da SMS 201-995 infuso alla dose di 5 µg kg-1 h-1 e da L-364,718, un antagonista del recettore CCK-1, dato a 0,5 mg kg-1 h-1. In queste condizioni, sia SMS che L-364,718 erano equipotenti nel ridurre la crescita del pancreas, mentre SMS era l’unico antagonista in grado di ridurre a un livello basale la CCK endogena liberata dalla diversione pancreas-bile (119). Questi dati indicano che la somatostatina e gli analoghi possono ridurre la crescita pancreatica stimolata da CCK esogena ed endogena rilasciata. Infine, è stato osservato che la somatostatina (SMS) infusa ad un tasso di 5 µg kg-1 h-1 per 2 giorni era in grado di prevenire totalmente gli aumenti indotti dalla caseina al 70% nel peso pancreatico e nel contenuto totale di RNA e DNA (94). Questa è un’altra prova che la somatostatina può controllare la crescita pancreatica indotta stimolata dal CCK endogeno rilasciato da una dieta ricca di proteine (50). Somministrato da solo come infusione iv per 7 giorni alla dose di 5 µg kg-1 h-1, SMS 201-995 ha causato riduzioni significative del peso del pancreas e dell’intestino accompagnate da diminuzioni del DNA e dell’RNA totali in entrambi gli organi. La CCK e l’IGF-1 plasmatici erano ridotti, mentre il contenuto totale di IGF-1 pancreatico era aumentato (120). Oltre alla CCK endogena, alcune osservazioni suggeriscono il possibile coinvolgimento dell’IGF-1 nel processo di controllo positivo della crescita nell’intestino e nel pancreas. Infatti, questo fattore di crescita è presente nell’intestino (28) e nel pancreas (56) e sono stati documentati recettori specifici sulle cellule di questi organi (76,162); sono stati postulati meccanismi d’azione paracrini o autocrini (29). La somatostatina può agire sul controllo di questi due organi attraverso un’inibizione del rilascio di IGF-1 accompagnata da un effetto simile sulla CCK intestinale.
Effetti della somatostatina sui tumori pancreatici
La somatostatina è stata caratterizzata come “l’interruttore universale” perché inibisce la maggior parte delle funzioni d’organo e cellulari alle quali è stata associata. Un ruolo per la somatostatina e i suoi analoghi nel trattamento del cancro al pancreas è stato suggerito perché queste molecole hanno inizialmente fornito una terapia adiuvante positiva e non tossica.
Nel criceto siriano dorato impiantato per via sottocutanea con cellule di adenocarcinoma pancreatico duttale WD, un trattamento cronico di 21 giorni con l’analogo della somatostatina (L-5-Br-Trp8)SS alla dose di 20 µg b.i.d., ha diminuito il peso tumorale del 44% e il volume tumorale del 22% (114). La somatostatina e il suo analogo RC-160 hanno anche dimostrato di inibire i cambiamenti preneoplastici e di diminuire l’incidenza dei tumori nei criceti esposti al cancerogeno pancreatico BOP; questi trattamenti hanno causato un aumento del numero di cellule tumorali apoptotiche (150). In un altro studio, il numero di recettori della somatostatina è aumentato sulle cellule tumorali dopo il trattamento con RC-160 (35). La crescita di cellule MIAPaCa-2 impiantate s.c. in topi nudi è stata inibita in modo dose-dipendente da iniezioni due volte al giorno di octreotide a 250 e 2500 µg kg-1 (160). Usando un’altra modalità di consegna del farmaco, le microcapsule, RC-160 consegnato a 1250 µg kg-1 d-1 ha inibito significativamente la crescita dei tumori MIAPaCa-2 nei topi nudi (110). L’incapacità della somatostatina o dei suoi analoghi di inibire la crescita tumorale potrebbe derivare dall’assenza del recettore SS come dimostrato nelle cellule tumorali pancreatiche umane PGER che sono irresponsabili alla SMS 201-995 (141). Nelle cellule MIAPaCa-2 e PANC-1 coltivate in DMEM contenente 10% di siero fetale di vitello, 1 µM di SS-14 e SMS 201-995 hanno inibito la crescita delle cellule PANC-1 con attivazione della tirosina fosfatasi SHP-1. Al contrario, SS e il suo analogo hanno causato la crescita della cellula MIAPaCa-2 e questo effetto di crescita potrebbe essere derivato dall’assenza di SHP-1 in queste cellule (31). Nelle cellule che rispondono alla somatostatina, è stato dimostrato in precedenza che SHP-1 si è co-purificato con il recettore della somatostatina (167). Un simile effetto stimolante la crescita della SMS è stato osservato nelle cellule BON (cellule carcinoidi pancreatiche umane) alla dose di 1 nM e 100 nM; questo effetto di crescita è stato accompagnato da riduzioni significative del contenuto di cAMP delle cellule senza influenzare l’idrolisi del PI (66).
La maggior parte degli studi clinici sugli analoghi della somatostatina nel trattamento adiuvante del cancro pancreatico non hanno dimostrato una risposta. Nessun effetto antitumorale è stato osservato in 14 pazienti con cancro pancreatico metastatico con tre iniezioni giornaliere s.c. di 100-200 µg di SMS per 7 settimane (72). In un altro studio, diciannove pazienti con carcinoma pancreatico esocrino avanzato hanno ricevuto l’analogo della somatostatina BIM23014 da 250 µg a 1 mg giorno-1 per 2 mesi. All’interno di questo gruppo, un paziente ha avuto una risposta parziale, 6 hanno avuto una malattia stabile e undici una malattia progressiva (20). Dagli studi effettuati su diverse cellule di cancro pancreatico e dalle varie risposte ottenute sulla loro crescita, sembra che una chiave del successo nella battaglia critica contro il cancro pancreatico sia l’espressione dei recettori specifici della somatostatina e l’uso dell’analogo specifico (37). Le proprietà dei cinque sottotipi clonati di recettori umani della somatostatina e le indicazioni stabilite, probabili e non stabilite per l’uso degli analoghi della somatostatina sono state riassunte nella referenza 77.
Uso clinico della somatostatina
Clinicamente, l’octreotide è stato usato nel trattamento della pancreatite acuta ma non è stato confermato un beneficio unanime. In uno studio (111), la somatostatina è stata somministrata in una dose iniziale in bolo di 250 µg seguita da 250 µg h-1 come infusione continua; il trattamento in 9 su 12 pazienti con pancreatite acuta ha invertito l’amilasemia e portato un miglioramento clinico ma non ha mostrato alcuna riduzione del tasso di mortalità. La somatostatina rimane comunque un trattamento efficace per le complicazioni locali consolidate della pancreatite acuta, come le fistole pancreatiche e le pseudocisti (112). In uno studio, pazienti con tumori endocrini pancreatici metastatici furono trattati inizialmente con 50 µg s.c. di octreotide ogni 12 ore e successivamente (6-16 mesi) la dose fu aumentata a 500 µg ogni 8 ore. Alcuni pazienti non risposero al trattamento mentre in altri fu efficace; i sintomi migliorarono ma alla fine si ripresentarono e tutti i pazienti morirono una volta raggiunta la fase di resistenza della loro malattia (163). Questi dati indicano che la somatostatina non è il trattamento ideale per la pancreatite ma può essere utile per trattare le complicazioni locali della malattia. L’SMS, tuttavia, ha dimostrato di essere molto efficace nell’eliminare la diarrea pancreatica e nel permettere la correzione della disidratazione e dell’acidosi. Il suo effetto ha portato alla marcata riduzione delle concentrazioni plasmatiche di VIP (84).
3. Strumenti per lo studio della somatostatina
a) Peptide
Somatostatina-14 e -28 sono disponibili in commercio. Il principale agonista utilizzato in vivo è l’octreotide (SMS 201-995) e gli altri sono: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 e L-362,855. Tra la serie BIM, BIM-23056 agisce come agonista sul recettore SST-3 e come antagonista sul recettore SST-5 (161). Le strutture chimiche di queste molecole sono presentate nella tabella 1.
b) Anticorpi e saggi
Anticorpi contro la somatostatina -14, -28, SMS 201-995 e RC-160 sono stati sviluppati in molti laboratori. Come esempio, Guillemin ha messo a punto un RIA utilizzando un antisiero di pecora BARBAR-78; questo antisiero è stato allevato contro la SS-14 sintetica e reagisce in modo incrociato con la SS-28 ovina sintetica in rapporto equimolare (15). È stato sviluppato anche un antisiero specifico contro l’SS-28 (67) e sono stati stabiliti anche dei RIA per l’SMS 201-995 (5) e l’RC-160 (83).
c) Modelli sperimentali
La maggior parte degli studi fisiologici eseguiti nell’uomo sono stati fatti su volontari sani maschi e femmine (30). Tra gli animali da esperimento, gli studi sono stati eseguiti soprattutto in cani coscienti con fistole gastriche e pancreatiche (146,147), in ratti coscienti con succo bilio-pancreatico deviato (25,127) e in ratti anestetizzati (39). Per l’effetto cronico della somatostatina sul pancreas, i ratti sono stati trattati quotidianamente con iniezioni s.c. di somatostatina (92). Gli studi in vitro sono stati eseguiti di solito con acini pancreatici appena preparati, lobuli isolati o pancreas perfuso isolato da ratto, topo o cavia (65, 96,139,158). Nella tabella 2, sono presentati alcuni dati sulle specie animali utilizzate, le dosi o concentrazioni di somatostatina e analoghi somministrati e gli effetti.