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ANNUNCIO DEL GENOMA

Escherichia coli BL21 e BL21(DE3), creati da F. William Studier e Barbara A. Moffatt (1), sono ceppi di laboratorio comuni per la produzione di proteine ricombinanti. La mancanza di proteasi lon e ompT, spesso considerate come caratteristiche comuni tra la stirpe B, ha guidato lo sviluppo di questi ceppi per l’espressione di proteine ospiti. E. coli BL21(DE3), un derivato di BL21, è probabilmente il più usato nell’espressione ad alto livello di proteine ricombinanti, e ospita un profago DE3 derivato da un batteriofago λ, che porta il gene T7 della RNA polimerasi sotto il controllo del promotore lacUV5. E. coli BL21 è stato usato abitualmente per l’espressione non T7, ed è stato anche recentemente modificato per produrre un vaccino a DNA plasmidico, grazie alle sue migliori prestazioni in colture fed-batch ad alta densità di cellule rispetto ai ceppi K-12 (2).

La sequenza del genoma di E. coli BL21(DE3) è stata precedentemente determinata dal nostro istituto (3). In linea di principio, la sequenza del genoma di BL21 sarebbe identica a quella di BL21(DE3), ad eccezione del profago DE3. Tuttavia, possono verificarsi variazioni da stock a stock che possono avere serie implicazioni per gli esperimenti (4). Con le informazioni sul genoma di E. coli BL21(DE3) come riferimento, la sequenza completa del genoma di BL21 è stata costruita usando solo il sequenziamento di prossima generazione, e le differenze genomiche base per base sono state identificate.

Il ceppo E. coli BL21 è stato acquistato da TaKaRa Bio (numero di codice 9126, numero di lotto K142). Il sequenziamento del genoma è stato effettuato presso lo Human Derived Material Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), utilizzando il sistema Illumina HiSeq 2000. La sequenza completa del genoma di BL21 è stata prodotta sia da una mappatura di riferimento elaborata che dall’assemblaggio de novo di 101-nt Illumina reads (47.123.524 paired-end reads da una libreria ~150-bp) usando il CLC Genomics Workbench versione 6.5.1 (CLC bio).

Ci aspettavamo che una sequenza modificata del genoma BL21 (DE3) (CP001509.3) – da cui è stata eliminata la regione del profago, lasciando una copia del sito di attacco lambda (attB) – potesse servire come migliore sequenza di riferimento. Tuttavia, l’analisi di copertura della prima mappatura ha mostrato che l’attB di BL21 non era vuoto ma occupato da un profago λ*B lungo 12,1 kb come in E. coli REL606 (3), che è stato riportato come una caratteristica comune tra la stirpe B (5). Una seconda prova di mappatura di riferimento, utilizzando una sequenza modificata con una sequenza di profago λ*B, ha rivelato un’altra regione a bassa copertura tra il gene ybhC e il limite sinistro del sito di attacco di lambda, attL. Confrontando le sequenze, la migliore sequenza corrispondente è stata identificata da contigs assemblati de novo ed era 23 bp più lunga della regione corrispondente di BL21(DE3). Una sequenza di riferimento aggiornata è stata quindi preparata sostituendo la regione a bassa copertura e il suo vicino (~ 200 bp), e la mappatura è stata effettuata di nuovo. La copertura uniforme della lettura sull’intera sequenza di riferimento finale è stata confermata dall’indagine visiva, e nessun’altra differenza è stata trovata dal rilevamento di SNV/variazioni strutturali basato sulla qualità o dall’analisi dei breakpoint. L’assemblaggio utilizzando letture non mappate non ha prodotto alcun contigs che possa sostenere la presenza di regioni specifiche di BL21. L’annotazione del genoma è stata effettuata dal servizio NCBI Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline (PGAAP).