COMMENTARIO
L’esclusione del colorante è una tecnica semplice e rapida che misura la vitalità cellulare, ma è soggetta al problema che la vitalità viene determinata indirettamente dall’integrità della membrana cellulare. Quindi, è possibile che la vitalità di una cellula sia stata compromessa (misurata dalla capacità di crescere o funzionare) anche se la sua integrità di membrana è (almeno transitoriamente) mantenuta. Al contrario, l’integrità della membrana cellulare può essere anormale, ma la cellula può essere in grado di ripararsi e diventare pienamente vitale. Un altro potenziale problema è che, poiché l’assorbimento del colorante è valutato soggettivamente, piccole quantità di assorbimento del colorante indicative di lesioni cellulari possono passare inosservate. A questo proposito, l’esclusione del colorante eseguita con un colorante fluorescente usando un microscopio a fluorescenza risulta abitualmente nel punteggio di più cellule non vitali con assorbimento del colorante rispetto ai test eseguiti con il blu trypan usando un microscopio a trasmissione.
Un metodo più sofisticato per misurare la vitalità cellulare è quello di determinare l’esclusione del colorante tramite citometria a flusso. Questo può essere fatto usando il blu di tipan poiché questa proteina si lega alle proteine e poi emette un segnale di fluorescenza che può essere rilevato in un citometro a flusso (a 660 nm quando si lega alla sieroalbumina bovina) (vedi riferimento 2 per i dettagli sull’uso del blu di tripan in citometria a flusso). In alternativa, l’esclusione può essere misurata con altri coloranti che emettono luce come lo ioduro di propidio (vedi Unità 5.4 per una descrizione dell’uso dello ioduro di propridium per la valutazione della vitalità cellulare mediante analisi citometrica a flusso). Il confronto dettagliato delle stime delle cellule vive rispetto a quelle morte usando l’esclusione del blu di tripan valutato manualmente come descritto qui e valutato elettronicamente con la citometria a flusso indica che le due tecniche forniscono risultati molto simili in mani esperte. Mentre la tecnica di esclusione del colorante descritta è più probabile che porti a un errore a causa della soggettività dell’operatore, l’approccio citometrico a flusso è meno adatto per la valutazione della vitalità cellulare durante l’esecuzione di tecniche di purificazione delle cellule complesse e che richiedono tempo. Pertanto, una tecnica citometrica a flusso è applicabile solo quando è necessario ottenere misure precise sul numero di cellule morte in una miscela di cellule.
Recentemente, è stato riportato un “test automatizzato di vitalità al microscopio a fluorescenza” in cui la vitalità cellulare utilizzando lo ioduro di propidio in combinazione con un dispositivo che conta le cellule vive e morte in un contatore di cellule al microscopio portatile dotato di un microchip. Si dice che questo contatore sia in grado di valutare la vitalità cellulare più rapidamente della tecnica manuale qui descritta o del citometro a flusso e di ottenere conteggi più precisi e affidabili. Questo dispositivo può essere utile in situazioni in cui sono necessari molti saggi di vitalità cellulare acquisiti rapidamente (3).
Si noti che la vitalità cellulare può essere valutata anche con coloranti che si legano al DNA (monoazide di etidio), agenti che si legano alla fosfatidilserina (Annexin V) e coloranti reattivi alle ammine. L’uso di questi agenti alternativi di solito richiede citometria a flusso ed è quindi applicabile solo in condizioni particolari.
Trypan blu esclusione, come descritto nel protocollo di cui sopra, può essere eseguita in 5 a 10 min.