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Presentazione del caso

Il presente caso deriva da una visita veterinaria di routine in un allevamento di 155 animali, con due razze ovine (Pelifolk e Blackbelly), situato a Tesistán, comune di Zapopan, stato di Jalisco, Messico. Le strutture di questo allevamento sono state adattate da un precedente allevamento di maiali, e sono ancora circondate da allevamenti di maiali e bovini nelle vicinanze. Il gregge era tenuto su pavimenti rialzati per facilitare la pulizia e la manipolazione, tuttavia molti oggetti taglienti arrostiti (come filo di ferro, recinzioni rotte, chiodi, ecc.) erano presenti nei recinti e la pulizia non veniva effettuata correttamente nell’allevamento al momento dell’ispezione. L’alimentazione si basava su mangimi disponibili localmente, come: foraggio grezzo di bassa qualità, letame-silicato di suino e concentrato di mangime commerciale ad alto contenuto proteico. Questa azienda ha chiamato i servizi veterinari a causa di frequenti ascessi cutanei riscontrati negli animali, non sono stati riportati altri reclami relativi a problemi cutanei. Gli ascessi non sembrano influenzare la produttività degli animali, tuttavia la presenza di tali lesioni influisce negativamente sulla commercializzazione degli animali, e quindi, il proprietario era interessato a scoprire l’agente eziologico e il trattamento consigliato per eliminare la malattia dall’azienda. Il contenuto degli ascessi è stato campionato da 31 animali (29 pecore, 1 montone e 1 agnello) da un veterinario certificato e inviato al laboratorio per la diagnosi batteriologica, al fine di trovare gli agenti eziologici che stavano causando il problema. In base all’aspetto degli ascessi, la diagnosi presuntiva dell’infezione nell’allevamento è stata di linfoadenite caseosa per la maggior parte degli animali. Tuttavia, l’analisi batteriologica ha dimostrato che 13 animali erano infettati da C. pseudotuberculosis, 1 da Corynebacterium spp, 2 da Proteus spp, 2 da Streptococcus spp, e nei restanti 13 casi l’agente patogeno non poteva essere identificato. La categorizzazione dell’isolato di Corynebacterium spp. non era chiara perché i risultati dei test batteriologici e biochimici non erano conclusivi.

Questo articolo descrive l’isolamento di C. xerosis da un agnello Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) di 4 mesi in buone condizioni fisiche. Per quanto ne sappiamo, questa è la prima segnalazione di C. xerosis che produce un ascesso cutaneo clinico nelle pecore. È stato ottenuto il consenso informato dal proprietario dell’animale per la pubblicazione dei risultati dello studio clinico, compreso il materiale fotografico. L’animale presentava un ascesso di consistenza dura, senza drenaggio, sul lato sinistro del collo (Fig. 1a). La diagnosi clinica iniziale suggeriva una linfoadenite caseosa, probabilmente causata da C.pseudotuberculosis. Un campione per l’analisi batteriologica è stato ottenuto perforando l’ascesso con una siringa sterile da 5 ml, con un ago ipodermico da 20 gauge dopo aver pulito e disinfettato la superficie dell’ascesso. Il tipo di essudato recuperato era di tipo sieroso e di aspetto bianco. Il campione biologico è stato conservato a 4 °C fino alla caratterizzazione biologica presso il Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 strada Toluca-Atlacomulco, Toluca, Messico, z.c. 50200). Il tempo tra il campionamento e la lavorazione non ha superato le 72 ore. Il campione è stato coltivato in duplicato, in agar sangue di pecora all’8% e incubato 24-48 ore a 37 °C in condizioni aerobiche e microaerofile. Sono state osservate colonie di 1,0 mm di diametro, non emolitiche, di colore giallo-marrone e dall’aspetto leggermente secco (Fig. 2a). Queste caratteristiche morfologiche non corrispondevano a quelle precedentemente descritte per C. pseudotuberculosis, ma sembravano piuttosto colonie di C. xerosis. Al microscopio (ingrandimento 10×; Fig. 2c) i batteri sono stati osservati come bastoncini Gram-positivi a forma di clava, pleomorfi, colorati in modo irregolare. I test biochimici hanno mostrato i seguenti risultati: Ferro triplo zucchero (STI,-), Lisina ferro agar (LIA,-), test del citrato (CIT,-), Solfuro Indolo-Motilità (SIM,-), Motilità, Indolo, Ornitina (MIO,-), Ossidativo-fermentativo (OF,-) Rosso metile (-), Acqua di peptone (-), Voger Pascaguer (-), Urea (-), Brodo di nitrato (+), Trealosio (+), Saccarosio (+), Maltosio (+) e fermentazione del glucosio (positivo a 37 °C e negativo a 42 °C). Questi risultati potrebbero corrispondere a un profilo di C. pseudotuberculosis, con l’eccezione del test dell’urea, che era negativo invece che positivo, e quindi meglio coincidere con un profilo di C. xerosis. I risultati diagnostici non erano conclusivi, quindi, anche se il sistema API non è specifico per identificare C. xerosis, abbiamo deciso di studiare l’isolato con questo sistema, per vedere se questo isolato poteva essere identificato come altre specie di Corynebacterium. Inoltre, per scoprire se questo isolato appartiene ad altre specie come C. freneyi e C. amycolatum che si trovano raramente nelle pecore, abbiamo testato se la colonia era in grado di crescere a 20 °C e se era in grado di fermentare il glucosio a 42 °C. L’isolato è cresciuto bene a 20 °C e non ha fermentato il glucosio a 42 °C, entrambe caratteristiche associate a C. xerosis e C. hansenii, quindi abbiamo deciso di eseguire un’analisi molecolare per scoprire se potevamo identificare molecolarmente l’isolato come C. xerosis. Abbiamo analizzato tre loci per aumentare la nostra accuratezza diagnostica. Abbiamo testato un gene normalmente assente in C. xerosis ma presente in C. pseudotuberculosis, il gene pld dove ci aspettavamo di non trovare alcun amplicone dopo il test PCR se l’isolato era C. xerosis in opposizione a C. pseudotuberculosis che amplificherà una banda di 203 bp; un secondo locus aveva come obiettivo l’amplificazione della regione dello spaziatore intergenico dei geni 16S-23S rRNA (16S-23S) utilizzando primer progettati per C. pseudotuberculosis, che sono stati riportati non funzionare per C. xerosis , e ci aspetteremmo anche nessuna banda di amplificazione per C. xerosis e una banda di 816 bp per C. pseudotuberculosis. Infine abbiamo eseguito l’amplificazione PCR e il sequenziamento del gene rpoB (446 bp), che è stato precedentemente segnalato per differenziare le specie di Corynebacterium. L’estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando un kit commerciale (KAPA Express Extract) seguendo il protocollo del produttore. Una tecnica Multiplex-PCR per l’amplificazione delle sequenze parziali dei geni pld, 16S-23S e rpoB è stata eseguita utilizzando il protocollo pubblicato da Pacheco nel 2007 . Le reazioni sono state effettuate utilizzando un kit PCR multiplex commerciale (QIAGEN Multiplex PCR) seguendo le specifiche del produttore. L’analisi PCR ha incluso i seguenti campioni: L’isolato da caratterizzare, l’isolato putativo di C. xerosis e due C. pseudotuberculosis (un isolato locale precedentemente caratterizzato come biovar ovis e un ceppo di riferimento, ATCC 43924, biovar equi) usati come controlli. Come previsto per il C. xerosis putativo, è stata amplificata una singola banda di amplificazione PCR 446 bp, corrispondente al frammento del gene rpoB, e i frammenti intergenici del gene 16S-23S e del gene pld non sono stati amplificati. Inoltre, come previsto, entrambi i ceppi di C. pseudotuberculosis hanno mostrato tre bande di 203, 446 e 816 bp, corrispondenti ai geni pld, rpoB e 16S, rispettivamente (Fig. 3). Gli ampliconi del gene RpoB di tutti e tre i campioni sono stati purificati utilizzando il kit di purificazione Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) e sono stati inviati per il sequenziamento automatico da Macrogen (Rockville, MD, USA). Gli allineamenti multipli di sequenza ottenuti da un BLAST (NCBI) sono stati analizzati insieme alle sequenze dei nostri isolati utilizzando l’analisi Clustal W di Mega 6.0.6 (Fig. 4). L’analisi filogenetica è stata eseguita utilizzando il metodo di vicinato (software MEGA 6.0.6). I valori di bootstrap sono stati ottenuti generando 1000 alberi casuali. L’analisi filogenetica ha incluso anche le sequenze del gene rpoB di C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) e C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). È stato possibile osservare diversi gruppi filogenetici che corrispondevano a particolari specie di Corynebacterium. Questi risultati, confermano che l’isolato di questo studio (rpoB C53) è C. xerosis (Fig. 4).

Le tecniche di genotipizzazione come la PCR e l’analisi della sequenza dell’isolato rpoB C53 in questo studio hanno contribuito notevolmente ad una corretta identificazione della specie, che inizialmente era fuorviante quando si usavano le caratteristiche fenotipiche microscopiche e biochimiche. Corynebacterium xerosis è stato precedentemente segnalato in campioni clinici di casi umani in lesioni in endocarditi, polmoniti, osteomieliti e infezioni della pelle, specialmente in pazienti immunocompromessi. È stata anche trovata in campioni clinici animali, per esempio, in lesioni del fegato di capra (sospetta pseudotubercolosi), e nel latte di mucca, da animali che presentano mastite. Nei suini, C. xerosis è stato isolato da lesioni in diversi tessuti come fegato, reni, polmoni, milza, articolazioni, così come da ascessi sottocutanei. Inoltre, C. xerosis è stata isolata da campioni clinici ovini di utero, in un caso di aborto, e da tessuto polmonare, da animali che presentavano problemi respiratori. Questi isolati sono stati identificati e caratterizzati dall’amplificazione del gene rRNA 16S-23S usando PCR-RFLP. Tuttavia, in questi studi, non è stato possibile ottenere un modello di banda abbastanza chiaro per differenziare C. xerosis da altre specie di Corynebacterium. Gli autori hanno anche condotto un’analisi e un confronto di sequenza dei geni 16S e rpoB, che ha permesso loro di differenziare C. xerosis da altre specie, geneticamente simili a Corynebacterium.

Come detto sopra, questo studio è stato condotto sulla base della presenza del gene rpoB, che è stato segnalato da altri autori come il gene di scelta per l’analisi filogenetica del genere Corynebacterium, in quanto presenta un elevato polimorfismo, anche superiore alla regione dello spaziatore intergenico dei geni 16S-23S rRNA. È noto che gli ascessi cutanei nelle pecore (linfoadenite caseosa) sono causati da C. pseudotuberculosis e il suo principale fattore di virulenza e patogenicità è l’esotossina fosfolipasi D, codificata dal gene pld ed espressa nella membrana cellulare del batterio. Questa esotossina è un fattore di permeabilità che promuove l’idrolisi dei legami esteri nella sfingomielina nelle membrane cellulari dei mammiferi, probabilmente contribuendo alla diffusione dei batteri dal sito iniziale di infezione a siti secondari attraverso il sistema linfatico ai gangli regionali, e sembra essere coinvolto nella riduzione della vitalità dei macrofagi dopo l’infezione. L’esotossina causa anche lesioni dermonecrotiche. Tuttavia, questa esotossina non è stata riportata in C. xerosis come tossina patogena che potrebbe contribuire allo sviluppo di ascessi. Questo evidenzia l’importanza di effettuare ulteriori ricerche sui meccanismi di infezione presenti in questa specie di Corynebacterium.

Un importante punto di discussione di natura epidemiologica, include il fatto che il sistema di produzione ovina, da cui è stato ottenuto il campione, è stato precedentemente utilizzato per i suini, una specie dove C. xerosis è stato segnalato come un patogeno comune. Inoltre, uno degli ingredienti principali dell’alimentazione delle pecore include sottoprodotti suini (letame suino-silaggio), che potrebbero eventualmente avere patogeni attivi, forse tra cui Corynebacterium spp. Inoltre, oggetti appuntiti come aste metalliche, chiodi e fili, sono diffusi in tutte le strutture, che aumentano la possibilità di lesioni degli animali, aprendo una via di ingresso di Corynebacterium spp. all’organismo tra cui C. xerosis. Tutti questi fattori possono aver contribuito alla presenza di C. xerosis all’interno della struttura. Non sono stati condotti ulteriori studi, tuttavia le raccomandazioni per il proprietario erano di sbrigliare e disinfettare gli ascessi di tutti gli animali, in una zona di contenimento delle infezioni (per evitare la diffusione degli agenti patogeni), rinforzare la pulizia dei recinti e rimuovere tutti i bordi e gli oggetti taglienti dai recinti, dalle mangiatoie e dai pavimenti. Poiché C. xerosis, così come C. pseudotuberculosis, sono microrganismi potenzialmente zoonotici, sono state fatte raccomandazioni all’allevatore per precauzioni estreme durante la manipolazione degli animali e dei rifiuti prodotti dall’azienda per prevenire l’infezione umana e animale e la possibile diffusione del microrganismo ad altre aziende.