Un approccio per prevenire i PD consiste nell’ottimizzazione fisico-chimica del sistema PCR, cioè cambiando le concentrazioni di primer, cloruro di magnesio, nucleotidi, forza ionica e temperatura della reazione. Questo metodo è in qualche modo limitato dalle caratteristiche fisico-chimiche che determinano anche l’efficienza dell’amplificazione della sequenza target nella PCR. Pertanto, ridurre la formazione di PDs può anche comportare una ridotta efficienza della PCR. Per superare questa limitazione, altri metodi mirano a ridurre la formazione di PDs solo, tra cui la progettazione del primer, e l’uso di diversi sistemi di enzimi PCR o reagenti.
Primer-design softwareEdit
Primer-design software utilizza algoritmi che controllano il potenziale di formazione della struttura secondaria del DNA e annealing di primer a se stesso o all’interno di coppie di primer. I parametri fisici che vengono presi in considerazione dal software sono la potenziale autocomplementarità e il contenuto di GC dei primer; temperature di fusione simili dei primer; e l’assenza di strutture secondarie, come gli stem-loops, nella sequenza target del DNA.
Hot-start PCREdit
Perché i primer sono progettati per avere una bassa complementarità tra loro, essi possono annealing (passo I nella figura) solo a bassa temperatura, ad esempio a temperatura ambiente, come durante la preparazione della miscela di reazione. Anche se le DNA polimerasi usate nella PCR sono più attive intorno ai 70 °C, hanno una certa attività di polimerizzazione anche a temperature inferiori, che può causare la sintesi del DNA dai primer dopo l’annealing tra loro. Sono stati sviluppati diversi metodi per prevenire la formazione di PDs fino a quando la reazione non raggiunge la temperatura di lavoro (60-70 °C), e questi includono l’inibizione iniziale della DNA polimerasi, o la separazione fisica dei componenti della reazione fino a quando la miscela di reazione raggiunge le temperature più alte. Questi metodi sono indicati come hot-start PCR.
Cera: in questo metodo l’enzima è spazialmente separato dalla miscela di reazione dalla cera che si scioglie quando la reazione raggiunge alte temperature.
Lento rilascio di magnesio: La DNA polimerasi richiede ioni di magnesio per l’attività, quindi il magnesio viene separato chimicamente dalla reazione legandosi a un composto chimico, e viene rilasciato nella soluzione solo ad alta temperatura
Legame non covalente dell’inibitore: in questo metodo un peptide, un anticorpo o un aptamero sono legati non covalentemente all’enzima a bassa temperatura e inibiscono la sua attività. Dopo un’incubazione di 1-5 minuti a 95 °C, l’inibitore viene rilasciato e la reazione inizia.
Taq polimerasi sensibile al freddo: è una DNA polimerasi modificata con attività quasi nulla a bassa temperatura.
Modifica chimica: in questo metodo una piccola molecola è legata covalentemente alla catena laterale di un amminoacido nel sito attivo della DNA polimerasi. La piccola molecola viene rilasciata dall’enzima mediante incubazione della miscela di reazione per 10-15 minuti a 95 °C. Una volta che la piccola molecola viene rilasciata, l’enzima viene attivato.
Modifiche strutturali dei primerModifica
Un altro approccio per prevenire o ridurre la formazione di PD è la modifica dei primer in modo che l’annealing con se stessi o tra loro non provochi l’estensione.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): una coda nucleotidica, complementare all’estremità 3′ del primer viene aggiunta all’estremità 5′ del primer. A causa della stretta vicinanza della coda 5′, essa si appaia all’estremità 3′ del primer. Il risultato è un primer stem-loop che esclude l’annealing che coinvolge sovrapposizioni più brevi, ma permette l’annealing del primer alla sua sequenza completamente complementare nel target.
Primer chimerici: alcune basi di DNA nel primer sono sostituite con basi di RNA, creando una sequenza chimerica. La temperatura di fusione di una sequenza chimerica con un’altra sequenza chimerica è inferiore a quella della sequenza chimerica con il DNA. Questa differenza permette di impostare la temperatura di annealing in modo tale che il primer si annerisca alla sua sequenza bersaglio, ma non ad altri primer chimerici.
Primer bloccabili: un metodo noto come RNase H-dependent PCR (rhPCR), utilizza una RNasi HII termostabile per rimuovere un gruppo bloccante dai primer PCR ad alta temperatura. Questo enzima RNase HII mostra quasi nessuna attività a bassa temperatura, rendendo la rimozione del blocco solo ad alta temperatura. L’enzima possiede anche intrinseco primer:template mismatch discriminazione, con conseguente ulteriore selezione contro primer-dimers.
Prevenire l’acquisizione del segnale da primer dimersEdit
Mentre i metodi di cui sopra sono progettati per ridurre la formazione PD, un altro approccio mira a minimizzare il segnale generato da PDs in PCR quantitativa. Questo approccio è utile fino a quando ci sono poche PD formate e il loro effetto inibitorio sull’accumulo del prodotto è minore.
Quattro passi PCR: utilizzato quando si lavora con coloranti aspecifici, come SYBR Green I. Si basa sulla diversa lunghezza, e quindi, diversa temperatura di fusione delle PD e la sequenza bersaglio. In questo metodo il segnale viene acquisito al di sotto della temperatura di fusione della sequenza bersaglio, ma al di sopra della temperatura di fusione delle PD.
Sonde specifiche per la sequenza: Le sonde TaqMan e molecular beacon generano il segnale solo in presenza della loro sequenza target (complementare), e questa maggiore specificità preclude l’acquisizione del segnale (ma non i possibili effetti inibitori sull’accumulo del prodotto) da parte delle PD.