Gli effetti dell’elevata attività della chinasi Src sono stati ampiamente studiati sia in vitro utilizzando una varietà di linee cellulari neoplastiche umane (Budde et al, 1994; Rosen et al., 1986; Biscardi et al., 1998; Bjorge et al., 1996; Bolen et al. 1987a; Cartwright et al., 1989; Weber et al., 1992; Lutz et al., 1998) e in vivo con modelli murini (Biscardi et al., 1998; Irby et al., 1999; Muthuswamy et al., 1994; Staley et al., 1997; Wiener et al., 1999). Utilizzando questi sistemi, i ricercatori hanno studiato le modalità di attivazione di Src, gli effetti di Src sull’inizio e la progressione del tumore, e gli effetti degli inibitori della tirosin-chinasi e antisenso sul comportamento cellulare. Questi studi illustrano la complessa rete di proteine interagenti con Src che hanno un impatto su numerose vie di trasduzione del segnale.
Dai primi anni ’80, un aumento dell’attività della chinasi Src è stato riportato in vari tumori umani apparentemente non correlati. Livelli elevati di proteina Src sono stati trovati in molti tumori, anche se il livello proteico potrebbe non riflettere accuratamente l’attività specifica della proteina chinasi. Per questo motivo, sono stati sviluppati saggi di chinasi affidabili utilizzando substrati esogeni per determinare l’attività specifica della proteina. I risultati di numerosi studi riflettono l’aumento dell’attività specifica di Src nei tumori umani e nelle linee cellulari derivate da tali tumori (Cartwright et al., 1989, 1990; Muthuswamy et al., 1994; Budde et al., 1994; Jacobs e Rubsamen, 1983; Mao et al., 1997; Masaki et al., 1998, 2000; Muthuswamy e Muller, 1994; Rosen et al, 1986; Verbeek et al., 1996).
Cancro al seno
L’attività della chinasi Src, da 4-20 volte superiore a quella dei tessuti normali, è stata trovata nei carcinomi mammari umani (Egan et al, 1999; Jacobs e Rubsamen, 1983; Muthuswamy e Muller, 1994; Muthuswamy et al., 1994; Ottenhoff-Kalff et al., 1992; Rosen et al., 1986; Verbeek et al., 1996). Allo stesso modo, le linee cellulari derivate da questi tumori mostrano fino a un aumento di 30 volte dell’attività di Src. Dati recenti hanno suggerito che parte di questa attività può essere attribuibile all’azione delle fosfatasi con conseguente defosforilazione di Tyr 530 (Egan et al., 1999). Rosen et al. (1986) hanno riportato un’elevata attività della chinasi Src nei tumori al seno con livelli relativamente normali di proteina Src rispetto al tessuto normale. D’altra parte, Verbeek et al. (1996) hanno presentato prove immunoistochimiche che un aumento di 4-30 volte dell’attività Src era accompagnato da un aumento dei livelli di proteina Src. Ottenhoff-Kalff et al. (1992) hanno trovato che 72/72 tumori al seno hanno mostrato un aumento dell’attività tirosin-chinasica, il 70% della quale è stata attribuita a c-Src o a Src like kinases.
Src attivato nei tumori mammari è stato ben studiato nei topi transgenici. Topi che esprimono l’antigene polyoma medio T virale sotto il controllo del promotore MMTV producono tumori mammari altamente metastatici con elevata attività della chinasi c-Src (Guy et al., 1994). Muthuswamy et al. (1994) hanno scoperto che i topi che sovraesprimono l’oncogene neu sviluppano anche tumori mammari con un’attività di c-Src chinasi 6-8 volte superiore rispetto al tessuto normale adiacente. Questi sono due esempi di Src attivato, uno un esempio di una proteina virale che si lega e attiva Src, causando tumori, e l’altro un esempio di un recettore tirosin-chinasi che causa l’attivazione di Src e conseguenti tumori mammari. Esperimenti su topi nudi (Biscardi et al., 1998) con linee cellulari di cancro al seno che sovraesprimono sia c-Src che HER1 (MDA-MB-468 e MDA-MB-231) rispetto a linee cellulari che sovraesprimono solo c-Src (MCF7 e ZR-75-1) hanno rivelato una maggiore tumorigenicità nei topi iniettati con le linee MDA. Questo supporta l’ipotesi che l’attivazione di Src può essere mediata attraverso le interazioni con HER1.
Cancro al colon
Il proto-oncogene c-src è stato frequentemente implicato nell’inizio e nella progressione del cancro al colon umano, e nelle metastasi risultanti (Bolen et al., 1987a; Cartwright et al., 1989, 1990, 1994; Talamonti et al., 1991; Termuhlen et al., 1993; Weber et al., 1992). L’attività di Src è aumentata di 5-8 volte nella maggior parte dei tumori del colon. Questa elevazione dell’attività Src, e della relativa attività Yes, è un evento precoce, che si verifica anche nei tessuti premaligni (Cartwright et al., 1994) e nei polipi adenomatosi (Cartwright et al., 1990; Pena et al., 1995). L’attività è apparentemente alta nei polipi maligni e nei polipi benigni che contengono cambiamenti villosi o displasia grave, che sono a maggior rischio di sviluppare il cancro. L’attività di Src è stata anche trovata elevata negli epiteli lievemente displastici (6-10 volte) se confrontata direttamente con epiteli adiacenti non displastici nella colite ulcerosa, aumentando ulteriormente nel tessuto gravemente displastico che è a maggior rischio di sviluppare il cancro (Cartwright et al., 1994).
Un ruolo di Src nella progressione tumorale è illustrato in modo toccante dalle osservazioni che l’attività di Src aumenta con la progressione dei tumori del colon, essendo più alta nei tumori primari che nei polipi e più alta ancora nelle lesioni epatiche metastatiche (Talamonti et al., 1991). La tendenza si riflette in sei campioni appaiati di lesioni primarie e metastatiche sincrone dello stesso paziente. Mentre i livelli di proteina Src variano ampiamente tra i pazienti, il livello di attività aumenta nelle metastasi epatiche rispetto a quello dei tumori primari sincroni, in misura molto maggiore rispetto agli aumenti dei livelli di proteina Src. Ulteriori differenze esistono nei livelli di Src attivata visti nelle metastasi colorettali in siti extraepatici (Termuhlen et al., 1993). Inoltre, le metastasi colorettali all’addome, al bacino e al torace hanno mostrato un aumento significativo dell’attività rispetto alle metastasi epatiche. Questi dati sollevano la questione se il sito di metastasi influenza l’attività specifica di Src o se l’attività specifica di Src influenza il sito della lesione metastatica.
L’influenza di Src nel cancro del colon è stata anche esplorata esaminando i livelli di Src nei tumori del colon di vari stati di differenziazione. I risultati riportati sono interessanti ma non sempre intuitivi. Weber et al. (1992) hanno riportato che i più alti livelli di attività di Src nei tumori del colon umano si sono verificati in tumori da moderatamente a ben differenziati, e i livelli sembrano abbastanza normali nei tumori del colon scarsamente differenziati, un risultato sostenuto da varie linee cellulari tumorali. Park et al. (1993) e Park e Cartwright (1995) hanno riportato un aumento di Src e della chinasi della famiglia Src, Yes, sia nelle linee cellulari del colon che nei tumori primari del colon, ma questi studi hanno mostrato una downregulation delle chinasi Src nelle cellule completamente differenziate. Questi risultati, in superficie, sono difficili da interpretare sapendo che i tumori scarsamente differenziati sono biologicamente più aggressivi dei tumori ben differenziati. La maggior parte delle metastasi epatiche colorettali, tuttavia, sono di fatto ben-moderatamente differenziate e questa prevalenza può spiegare i risultati osservati.
Il ruolo di Src nel cancro al colon è stato recentemente esaminato utilizzando il modello di topo nudo iniettato con varie linee cellulari di cancro al colon (Irby et al., 1997; Staley et al., 1997). Staley et al. (1997) hanno trasfettato la linea cellulare di cancro al colon HT 29 con un vettore antisenso progettato per ridurre l’espressione di c-Src ma non di c-Yes. Quando sono state iniettate in topi nudi, queste cellule hanno formato tumori a crescita lenta con un tasso di proliferazione ritardato ulteriormente rispetto al tasso di proliferazione ridotto delle cellule parentali cresciute in coltura. Al contrario, le cellule trasfettate in modo stabile con un vettore di senso non hanno mostrato alcuna differenza nella proliferazione in coltura o in topi nudi dalle cellule HT 29 wild-type. In un secondo studio che cercava di determinare gli effetti fenotipici della sovraespressione di c-Src wild-type sulle cellule di cancro al colon umano, cellule di cancro al colon KM12C trasfettate con c-Src che esprimevano fino a 10 volte più c-Src delle cellule wild-type sono state iniettate sottocutaneamente e intrasplenicamente in topi nudi (Irby et al., 1997). Le cellule con un livello più alto di espressione di c-Src hanno formato tumori a crescita più rapida rispetto alle cellule wild-type, ma non hanno formato metastasi epatiche. È interessante notare che le cellule trasfettate e quelle wild-type coltivate in vitro hanno mostrato tassi di proliferazione simili. Questi due studi indicano che, in primo luogo, il livello di Src e la sua attività alterano proporzionalmente il tasso di crescita tumorale in vivo e, in secondo luogo, i tassi di crescita in vitro non riflettono necessariamente i tassi di crescita delle cellule in vivo. Questo suggerisce che la crescita delle cellule tumorali è fortemente influenzata dal microambiente, e forse indica il potenziale dell’attività di Src nella cellula tumorale di influenzare l’espressione delle proteine promotrici del tumore da parte dell’ospite. Questi studi dimostrano anche che l’iperespressione di c-Src wild-type da sola, mentre influenza chiaramente la crescita tumorale in vivo, può essere insufficiente per indurre il fenotipo metastatico.
Cancro pancreatico
L’attività di Src è stata recentemente studiata nel cancro pancreatico. Lutz et al. (1998) hanno esaminato i carcinomi duttali pancreatici e le linee cellulari pancreatiche per i livelli elevati di proteina Src e l’attività della chinasi. I livelli della proteina Src erano elevati in 13/13 tumori pancreatici e in 14/17 linee cellulari pancreatiche. L’attività della chinasi era rilevabile solo nelle cellule tumorali e questa attività non era correlata ai livelli della proteina c-Src o Csk. Ulteriori studi utilizzando l’inibitore della tirosin-chinasi, l’erbimicina A, hanno indicato che l’attività di Src era determinante nel promuovere la crescita delle cellule tumorali pancreatiche. Un metodo con cui Src aumenta la crescita del tumore pancreatico è stato suggerito da Flossmann-Kast et al. (1998). Questo gruppo ha scoperto che Src causa un aumento del numero di molecole del recettore del fattore di crescita insulino-simile (IGF-R) per cellula, aumentando così la crescita IGF-dipendente. In un altro studio basato su un modello di carcinogenesi pancreatica nel ratto (Visser et al., 1996), un aumento dell’attività della chinasi Src era correlato positivamente al numero di lesioni presenti nel pancreas. Questo aumento di attività è stato accompagnato da una rilocalizzazione della proteina c-Src al nucleo, suggerendo un ruolo di Src nella regolazione genica.
Cancri vari
Livelli elevati di proteina Src e/o attività chinasica sono stati riportati nei polmoni (50-80%) (Mazurenko et al., 1992), neurali (23/27 neuroblastomi, 3/3 retinoblastomi) (Bjelfman et al, 1990; Bolen et al., 1985), ovarico (Budde et al., 1994; Wiener et al., 1999), esofageo (aumento dell’attività di 3-4 volte nell’esofago di Barrett e aumento di sei volte negli adenocarcinomi) (Kumble et al., 1997) e gastrico (Takeshima et al., 1991), così come il melanoma (Bjorge et al., 1996) e il sarcoma di Kaposi (Munshi et al., 2000). Le chinasi della famiglia Src Lck, Lyn e Fgr hanno dimostrato di essere attivate durante la crescita delle cellule leucemiche (Abts et al., 1991) (Dai et al., 1998; Danhauser-Riedl et al., 1996; Roginskaya et al., 1999).