Espressione e purificazione di GyrB e GyrA
La sequenza che codifica per la lunghezza completa di E. coli GyrA (2-875) è stata inserita in una pET28b modificata contenente un tag N-terminale 10-His e un tag C-terminale Twin-strep. La sovraespressione è stata eseguita in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in terreno LB contenente 50 µg/mL di kanamicina e 35 µg/mL di cloramfenicolo. Le cellule sono state indotte con 0,35 mM IPTG dopo aver raggiunto un OD600 0,85 e la proteina è stata espressa a 37 ° C per 4 ore. Le cellule sono state raccolte e risospese in tampone di lisi (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 10% v/v glicerolo, pH 8,0) e lisato con tre cicli di rottura ad alta pressione utilizzando EmulsiFlex-C3 a 1500 bar. La proteina GyrA è stata purificata mediante cromatografia di affinità al nichel su una colonna XK 26/20 confezionata manualmente (Pharmacia) con resina Chelating Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) legata a ioni Ni2+. Eluizione è stata eseguita con il tampone di lisi contenente 250 mM imidazol pH 8.0 e proteine eluiti sono stati direttamente attaccati su un 10 ml Streptavidin Sepharose (GE Healthcare). Le proteine sono state ampiamente lavate con tampone Strep (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerolo, pH 8.0) ed eluite con tampone Strep contenente 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Sia 10-His tag e Twin-strep tag sono stati successivamente scisso da PreScission proteasi (P3C) e Tobacco Etch Virus (TEV) scissione (rapporto di massa 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) durante la notte a 4 ° C. GyrA è stato poi ulteriormente purificato da un passo cromatografia a scambio anionico utilizzando una colonna HiTrap Q HP (GE Healthcare). La proteina è stata eluita con un gradiente lineare di 20 volumi di colonna con tampone B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerolo, pH 8,0). Le frazioni contenenti GyrA sono stati raggruppati e caricati su un Superdex S200 16/60 size-exclusion colonna cromatografia (GE Healthcare) utilizzando 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v / v glicerolo, pH 8,0. 37 mg di GyrA sono stati ottenuti da 3 L di colture. La sequenza codificante di GyrB (2-804) è stata inserita nella stessa pET28b modificata. La sovraespressione è stata eseguita in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in terreno LB contenente 50 µg/mL di kanamicina e 35 µg/mL di cloramfenicolo. Le cellule sono state indotte con 0.35 mM IPTG dopo aver raggiunto un OD600 0.85 e la proteina è stata espressa a 18 °C per 18 h. La procedura di purificazione di GyrB è come descritto sopra per GyrA. 10 mg di GyrB sono stati ottenuti da 3 L di colture.
Ricostituzione completa della girasi del DNA
E. coli GyrA e GyrB sono stati mescolati in rapporto equimolare per permettere la ricostituzione completa della girasi del DNA. Il complesso è stato ulteriormente purificato su un Superdex S200 16/60 size-exclusion colonna cromatografia (GE Healthcare) utilizzando cryo-EM buffer (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 e Fig. 1).
Preparazione dell’acido nucleico
Un duplex di DNA 180 bp a doppio nido è stato ricostituito utilizzando 2 oligonucleotidi sintetici asimmetrici fosforilati12 ottenuti da Sigma-Aldrich (Tabella 1 supplementare). Brevemente, gli acidi nucleici sono stati sciolti in acqua priva di DNAse a 1 mM concentrazione. Per assemblare il DNA a doppio filamento, ogni oligo è stato miscelato a 1:1 rapporto molare, annealed incubando a 95 ° C per 2 min e poi diminuendo la temperatura di 1 ° C ogni 1 min fino a raggiungere 20 ° C. Il duplex di DNA doppiamente scalfito annealed è stato poi tamponato in Hepes 20 mM pH 8.0 con una colonna BioSpin 6 (BioRad).
Formazione del complesso per cryo-EM
La DNA gyrase purificata è stata mescolata con il dsDNA 180 bp in rapporto molare 1:1 con una concentrazione finale di proteine e DNA di 32 µM. La miscela è stata incubata per 10 minuti a 37 °C. La gepotidacina (GSK2140944, acquistata presso MedChemExpress) risospesa a 10 mM in 100% DMSO è stata aggiunta per raggiungere una concentrazione finale di 170 µM (1,7% DMSO). La miscela è stata incubata per 10 minuti a 37 °C. AMP-PNP (Sigma) è stato aggiunto al complesso ad una concentrazione finale di 340 µM. Il complesso completamente ricostituito è stato ulteriormente incubato 30 min a 30 °C. Infine, al complesso è stato aggiunto 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich). Il campione è stato centrifugato per 2 ore a 16.000 × g per rimuovere potenziali aggregati.
Preparazione della griglia Crio-EM
Le griglie di rame 300 mesh del Quantifoil R-1.2/1.3 sono state caricate a incandescenza per 20 s prima dell’applicazione di 4 µl del complesso. Dopo 30 s di incubazione, le griglie sono state congelate in etano liquido utilizzando un Vitrobot mark IV (FEI) con il 95% di umidità della camera a 10 °C.
Microscopia elettronica
L’imaging crio-EM è stato eseguito su un microscopio Titan Krios operato a 300 kV (FEI) dotato di un K2 Summit direct electron camera (Gatan), un filtro energetico GIF Quantum (Gatan) operato in modalità zero-energy-loss con una larghezza fessura di 20 e-V, un Volta Phase Plate (FEI) e un correttore CS (FEI). Le immagini sono state registrate in modalità EFTEM nanoprobe con Serial EM53 in modalità di conteggio super-risoluzione a ingrandimento nominale di 130,000x con una dimensione del pixel super-risoluzione di 0.44 Å e un obiettivo costante defocus di -500 nm (Supplementary Fig. 2c). Il VPP è stato avanzato in una nuova posizione ogni 100 min (Fig. 2b supplementare). Quattro set di dati sono stati raccolti con un tasso di dose di 6 a 8 e-/pixel / s (0,88 Å dimensione del pixel al campione) sul rivelatore. Le immagini sono state registrate con una dose totale di 50 e-/Å2, tempo di esposizione tra 7 a 10 s e 0,2 a 0,25 s subframes (35 a 50 frame totale). Un totale di 11.833 filmati sono stati registrati dopo la raccolta dei dati dei 4 set di dati.
L’elaborazione dei dati
L’elaborazione dei dati di ogni set di dati è stata fatta separatamente seguendo la stessa procedura fino ai perfezionamenti 3D quando le particelle sono state unite. Il super-risoluzione dose-frazionato subframes sono stati corretti guadagno con IMOD54 e binned due volte da Fourier-cropping, drift-corrected e dose ponderata utilizzando MotionCor255 producendo immagini sommate con 0,88 Å dimensione del pixel. La funzione di trasferimento del contrasto delle micrografie corretto è stato stimato utilizzando GCTF v1.0656. Anelli Thon sono stati controllati manualmente per astigmatismo e micrografie con risoluzioni misurate peggio di 4 Å sono stati scartati rendendo 8.701 micrografie rimanenti. Le particelle sono state raccolte automaticamente da riferimento-free protocollo blob gaussiano raccolta in RELION229,30. Prendendo insieme i 4 set di dati, un totale di 1.572.962 particelle sono stati selezionati. Quattro volte le particelle cestinate da ogni set di dati sono stati separatamente sottoposti a due turni di classificazione 2D in RELION2 per rimuovere le particelle spazzatura e contaminazioni risultante in un totale di 479.667 particelle per l’ulteriore elaborazione. Le particelle dei quattro set di dati sono state fuse in un unico set di dati seguito da una riestrazione con centratura in formato 3 × 3 binned. Un ultimo giro di classificazione 2D è stato poi eseguito producendo uno stack di particelle finale di 338.616 particelle. Il successivo stack di particelle è stato sottoposto a un giro di classificazione 3D ab-initio in cryoSPARC31. Dopo aver scartato i modelli di scarsa qualità, il restante modello ab-initio risultato in un set di dati finale di 191.456 particelle, con una soglia di probabilità di classe di 0,9 (Supplementary Fig. 2a). Il modello ab-initio è stato filtrato passa-basso a 30 Å ed è stato utilizzato come riferimento per il perfezionamento omogeneo in cryoSPARC con conseguente 5,4 Å mappa. Le coordinate delle particelle raffinate sono state poi utilizzate per la stima CTF locale utilizzando GCTF v1.06 seguita da una ri-estrazione di 2 × 2 particelle cestinate con centratura. Questo nuovo stack di particelle è stato sottoposto a un 3D auto-refinement in RELION2 utilizzando il modello ab-initio filtrato a 30 Å producendo una mappa con una risoluzione globale di 5.0 Å (Fig. 3 supplementare). La risoluzione locale ha mostrato una gamma di risoluzione da 4.0 Å nel nucleo di DNA-binding/cleavage a 9.0 Å nel dominio ATPase e la ruota a perno β di GyrA che avvolge il DNA, indicando un’alta flessibilità di questi due moduli. Per ottenere una ricostruzione finale del complesso completo con densità ben definite per ogni dominio, abbiamo eseguito la classificazione 3D senza allineamento, ottenendo diverse classi diverse. Le particelle di tre classi sono state unite (94.633 particelle). Il successivo stack di particelle 1 × 1-binned è stato raffinato in RELION2 senza maschera fino alle ultime iterazioni di raffinamento dove è stata applicata una maschera morbida per migliorare la risoluzione. Post-elaborazione della mappa ha prodotto una ricostruzione 6,6 Å risoluzione del complesso complessivo (Supplementary Fig. 3).
Una combinazione di diversi approcci locali è stato utilizzato per identificare diverse conformazioni e per migliorare la risoluzione locale di ogni dominio. Poiché il dominio ATPase era troppo piccolo per un raffinamento 3D focalizzato, abbiamo prima eseguito una classificazione 3D focalizzata del dominio ATPase con una maschera morbida e nessun allineamento in RELION2. Una classe di 58.329 particelle con una densità ben definita del dominio ATPasi è stato selezionato, seguita da ri-estrazione di 1 × 1-binned particelle producendo particelle con dimensioni del pixel di 0,88 Å/pixel. Per facilitare un allineamento accurato delle particelle, questa classe è stata ulteriormente raffinata in RELION2 utilizzando una maschera morbida intorno al dominio ATPasi e il DNA-binding/cleavage dominio producendo un 5.9 Å mappa risoluzione globale (ATPase-Core) (Supplementary Fig. 3).
In secondo luogo, abbiamo eseguito una classificazione mirata 3D del GyrA β-rotella con una maschera morbida e nessun allineamento in RELION2. Una classe di 45.040 particelle con una densità ben definita del GyrA β-rotella è stata selezionata, seguita da una ri-estrazione di particelle 1 × 1-binned producendo particelle con dimensioni del pixel di 0,88 Å/pixel. Questa classe è stata ulteriormente raffinata in RELION2 utilizzando una maschera morbida intorno al β-rotella e il DNA-binding / depurazione dominio producendo un 6,3 Å mappa risoluzione (CTD-Core).
Infine, un focalizzato 3D auto-raffinamento è stato eseguito in RELION2 utilizzando una maschera morbida intorno al DNA-binding / depurazione dominio. La post-elaborazione della mappa ha prodotto una ricostruzione a 4,3 Å di risoluzione del dominio DNA-binding/cleavage. Poi, una classificazione 3D focalizzata del DNA-binding/cleavage dominio è stato eseguito. Due delle classi hanno mostrato migliori accuratezze angolari e distinte conformazioni chiuse (60.548 particelle) e pre-apertura (53.655 particelle) del dominio DNA-binding/cleavage. Queste due classi sono state ulteriormente raffinate in RELION2 dal perfezionamento 3D focalizzato con una simmetria C2 utilizzando 1 × 1 particelle cestinate e ha dato ricostruzioni con risoluzione globale di 4.0 e 4.6 Å dopo post-processing, rispettivamente (Fig. 3 supplementare). Il chiuso DNA-binding/cleavage dominio è stato ulteriormente raffinato dal perfezionamento 3D focalizzata utilizzando una maschera morbida, che esclude l’inserzione TOPRIM disordinato dando una mappa 4,0 Å di alta qualità (Fig. 3 supplementare).
Tutte le risoluzioni riportate si basano sul gold standard FSC-0.143 criterio57 e FSC-curve sono stati corretti per gli effetti di convoluzione di una maschera morbida utilizzando ad alta risoluzione rumore-sostituzione58 in RELION2 così come in cryoSPARC (Supplementary Fig. 4a). Tutte le ricostruzioni sono state affilate applicando un fattore B negativo che è stato stimato utilizzando procedure automatizzate 59. Risoluzione locale delle mappe è stato calcolato utilizzando Blocres60 (Fig. 4c supplementare). Le mappe cryo-EM del complesso complessivo, ATPase-core, CTD-core e il DNA-binding/cleavage dominio in chiuso (con e senza inserimento TOPRIM) e in stato di pre-apertura sono stati depositati in EM Data Bank sotto i numeri di adesione EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, rispettivamente.
Costruzione e raffinamento del modello
La ricostruzione EM del dominio di legame/scioglimento del DNA privo dell’inserzione TOPRIM risolto a 4,0 Å era della migliore qualità. Quasi tutte le catene laterali potevano essere viste e la densità della gepotidacina era chiaramente visibile. Questa mappa è stata utilizzata per perfezionare una struttura di cristallo del DNA-binding/cleavage dominio del E. coli DNA gyrase17. Un modello atomico dimerico del DNA-binding/cleavage dominio è stato generato utilizzando PDB 3NUH in PyMol (Schrodinger L.L.C.). Il successivo modello atomico è stato privato degli aminoacidi appartenenti all’inserzione TOPRIM, di tutti gli ioni e delle molecole d’acqua, con tutte le occupazioni impostate a 1 e i fattori B impostati a 50. In primo luogo, il modello atomico è stato montato a corpo rigido nella mappa filtrata e affilata con Chimera61. Un primo giro di perfezionamento nello spazio reale in PHENIX62 è stato eseguito utilizzando locale real-space fitting e globale gradiente-driven minimizzazione perfezionamento. Poi, 20 acidi nucleici dalla struttura di S. aureus DNA gyrase41 (PDB 5IWM) sono stati copiati e inseriti nel nostro modello atomico. La sequenza del DNA è stata modificata in base al DNA usato nella nostra struttura. I residui proteici e gli acidi nucleici mancanti sono stati costruiti manualmente in COOT63. Il modello atomico e il dizionario dei vincoli della gepotidacina (GSK-2140944) sono stati generati con il server Grade (http://grade.globalphasing.org). La gepotidacina è stata poi montata manualmente nella densità elettronica vuota in COOT e poi duplicata. Entrambi i duplicati sono stati impostati su 0,5 di occupazione. Sono stati eseguiti diversi cicli di raffinamento nello spazio reale in PHENIX utilizzando vincoli per la struttura secondaria, i rotamers, Ramachandran e la simmetria non cristallografica, sempre seguiti da un controllo manuale in COOT, fino ad ottenere un modello convergente. Infine, i fattori B sono stati raffinati da un ultimo giro di raffinamento nello spazio reale in PHENIX usando le stesse impostazioni di prima. Dopo che il raffinamento è convergente, le coordinate atomiche dell’inserzione TOPRIM sono state aggiunte al modello atomico. È stato ulteriormente raffinato nelle ricostruzioni EM contenenti la densità dell’inserzione negli stati chiusi e pre-aperti usando la stessa procedura. È stata eseguita una convalida incrociata a metà mappa per definire 1,5 come il miglior peso di raffinamento in PHENIX che consente la riduzione degli scontri atomici e la prevenzione dell’overfitting del modello (Fig. 4e supplementare). Tutti i passaggi di raffinamento sono stati fatti utilizzando il limite di risoluzione delle ricostruzioni secondo il criterio gold standard FSC-0.14357. Parametri di perfezionamento, statistiche modello e punteggi di convalida sono riassunti nella tabella supplementare 2. I modelli atomici del E. coli DNA-binding/cleavage dominio in conformazioni chiuse (con e senza inserimento) e pre-apertura sono stati depositati in Protein Data Bank sotto i numeri di adesione 6RKU, 6RKS, 6RKV, rispettivamente.
Per il complesso complessivo, abbiamo usato una combinazione di diverse ricostruzioni EM per costruire il modello atomico complesso DNA gyrase. La struttura ATPase-Core risolta a 5,9 Å è stata usata per adattare in Chimera la struttura cristallina del dominio ATPase in complesso con ADPNP32 (PDB 1EI1) e il dominio DNA-binding/cleavage raffinato in conformazione chiusa. La qualità della densità elettronica ha permesso di costruire in COOT i residui mancanti del linker tra il dominio ATPasi e il dominio DNA-binding/cleavage. La struttura CTD-Core risolta a 6,3 Å è stata utilizzata per adattare accuratamente il corpo rigido della struttura cristallina β-pinwheel10 in Chimera. I 10 aminoacidi mancanti (564-574) dopo il GyrA-box sono stati aggiunti utilizzando il server di modellazione Phyre264. La qualità della densità elettronica ha permesso di costruire in COOT gli acidi nucleici mancanti intorno alla β-rotella e i 10 aminoacidi che collegano gli ultimi residui di GyrA alla β-rotella. Sulla base di una predizione della struttura secondaria, una parte del linker è stata costruita come un’alfa-elica (Fig. 3). Il successivo modello atomico contenente il dominio dell’ATPasi, il dominio del DNA-binding/cleavage e una rotella β è stato montato a corpo rigido nella struttura complessiva del complesso risolto a 6,6 Å usando Chimera. Poi, una copia della prima ruota β è stata inserita nella densità della seconda ruota β in COOT. Gli acidi nucleici mancanti intorno alla seconda ruota β e i 10 residui mancanti del linker sono stati costruiti manualmente in COOT. Il modello atomico risultante è stato privato di tutti gli ioni e delle molecole d’acqua, con tutte le occupazioni impostate a 1 e i fattori B impostati a 50. Infine, il raffinamento nello spazio reale del modello atomico rispetto alla struttura complessiva del complesso è stato eseguito in PHENIX utilizzando il corpo rigido e la minimizzazione globale guidata dal gradiente di raffinamento. Limite di risoluzione per il perfezionamento è stato impostato secondo il gold standard FSC-0.143 criterio57. Half-map cross-validazioni sono state eseguite anche (Fig. 4e supplementare). Parametri di raffinamento, le statistiche del modello e punteggi di convalida sono riassunti nella tabella supplementare 2. Il modello atomico della struttura complessiva è stato depositato nella Banca dati della proteina sotto i numeri di adesione 6RKW. Tutte le figure sono state create con Chimera61, ChimeraX65 e PyMol (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q, e E264A purificazione
La pET28b modificata usata per la sovraesposizione di E. coli GyrB sovraespressione è stato mutato da site-directed mutagenesi utilizzando il QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) al fine di generare tre plasmidi che ospitano R286K, R286Q, o mutazioni E264A (Tabella 4 supplementare). Le procedure di sovraespressione e purificazione per i tre mutanti sono identiche al GyrB wild-type descritto sopra nella sezione Metodi.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q purificazione
Il pET28b modificato utilizzato per il wild-type T. thermophilus GyrB overexpression12 è stato mutato da site-directed mutagenesi utilizzando il QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) al fine di generare due plasmidi che ospitano K284R o K284Q mutazioni (Tabella supplementare 4). Procedure di sovraespressione e purificazione per i due mutanti sono identici a E. coli wild-type GyrB descritto sopra nella sezione Metodi.
Saggio di supercoiling del DNA
Una concentrazione crescente di DNA girasi (GyrA2B2) è stata incubata a 37 °C con 6 nM di plasmide pUC19 rilassato in una miscela di reazione contenente 20 mM Tris-acetato pH 7.9, 100 mM potassio acetato, 10 mM magnesio acetato, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Dopo 30 min, le reazioni sono state fermate con l’aggiunta di SDS 1%. L’elettroforesi su gel di agarosio è stata usata per monitorare la conversione della pUC19 rilassata nella forma superavvolta. I campioni sono stati eseguiti su un gel di agarosio allo 0,8%, tampone 1X Tris Borato EDTA (TBE), a 6 V/cm per 180 min a temperatura ambiente. I gel di agarosio sono stati colorati con 0,5 mg/ml di bromuro di etidio in 1X TBE per 15 minuti, seguiti da 5 minuti di decantazione in acqua. I topoisomeri del DNA sono stati rivelati usando un Typhoon (GE Healthcare).
Saggio dell’attività dell’ATPasi
L’idrolisi dell’ATP viene misurata seguendo l’ossidazione del NADH mediata dalla piruvato chinasi (PK) e dalla lattato deidrogenasi (LDH). L’assorbanza è stata monitorata a 340 nm per 600 s a 37 °C con uno spettrofotometro Shimadzu 1700. Le reazioni sono state registrate in triplicato con 50-100 nM di GyrA2B2 e 16 nM di DNA lineare (pCR-blunt) in 500 µl di un buffer contenente 50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM acetato di potassio, 8 mM acetato di magnesio, 7 mM BME, 100 µg/mg di BSA, 4U/5U di miscela PK/LDH, 2 mM PEP e 0.2 mM NADH.
Allineamento multiplo e conservazione evolutiva dei residui
Le sequenze della proteina ATPasi/Trasduttore GyrB di 30 specie (codici Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) sono stati allineati utilizzando il server Clustal Omega (EMBL-EBI). Il successivo allineamento è stato utilizzato per tracciare la conservazione evolutiva degli aminoacidi sulla struttura dell’ATPase/transduttore (PDB ID 1EI1) utilizzando il server ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). L’albero filogenetico è stato generato con il metodo neighbour-joining usando l’allineamento multiplo in Clustal Omega.
Reporting summary
Più informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.