Suscettibilità antimicrobica in vitro di Aerococcus urinae a 14 antibiotici, e curve time-kill per penicillina, gentamicina e vancomicina

Abstract

Aerococcus urinae è un nuovo arrivato nella pratica clinica e microbiologica, causando infezioni del tratto urinario, batteriemia/septicemia e/o endocardite. Questo studio presenta per la prima volta una valutazione dell’attività di un pannello rappresentativo di antibiotici contro un gran numero di isolati di A. urinae. Le suscettibilità in vitro (MIC) di 56 isolati di A. urinae a 14 antibiotici sono state determinate mediante diluizione in agar. In generale, gli isolati di A. urinae hanno mostrato una scarsa variabilità inter-isolata e hanno avuto basse MIC di penicillina, amoxicillina, piperacillina, cefepime, vancomicina e rifampicina. La resistenza agli aminoglicosidi di alto livello non è stata trovata per nessuno degli isolati. Un’attività da moderata a buona è stata osservata con i chinoloni, l’eritromicina e la tetraciclina. Gli isolati di due pazienti con endocardite sono stati studiati con curve time-kill per penicillina, gentamicina e vancomicina. La penicillina e la vancomicina da sole hanno mostrato un’attività battericida lenta o nulla contro i due ceppi. Quando si combina la penicillina o la vancomicina con la gentamicina, si è ottenuta una rapida attività battericida per entrambi i ceppi con entrambe le combinazioni. Le opzioni di trattamento per A. urinae sembrano includere le penicilline per i casi meno gravi. Nei casi gravi, cioè l’endocardite, le indagini time-kill suggeriscono un effetto benefico della combinazione con la gentamicina. Nel paziente allergico alla penicillina la vancomicina in combinazione con la gentamicina rappresenta l’alternativa più ovvia.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni la rilevanza clinica di vari cocchi Gram-positivi catalasi-negativi ha ricevuto molta attenzione.1 Tra questi, Aerococcus urinae è un nuovo arrivato nella pratica clinica e microbiologica, segnalato per la prima volta nel 19892 e designato nel 1992.3A. urinae sono stati originariamente riconosciuti per la loro morfologia cellulare (Staphylococcus-like alla colorazione di Gram) e le caratteristiche di crescita (simile agli streptococchi α-emolitici su agar sangue), una reazione negativa alla catalasi, e un antibiogramma molto costante che dimostra la suscettibilità alla penicillina e la resistenza ai sulfamidici e agli aminoglicosidi.2-4 In due rapporti i ceppi di A. urinae sono stati isolati dallo 0,4-0,8% dei campioni di urina esaminati.2,5 La maggior parte dei pazienti da cui è stato isolato A. urinae erano anziani con condizioni predisponenti e segni di infezione del tratto urinario.2,4,5 I ceppi che causano infezioni del tratto urinario sono stati riconosciuti in Danimarca, Svezia, Paesi Bassi, Francia, USA, Canada e paesi del Sud America.6A. urinae è stato isolato anche dal sangue di pazienti affetti da batteriemia/ setticemia urogenica con o senza endocardite.7-11 Un’indagine nazionale in Danimarca dal 1987 al 1995 ha identificato 26 pazienti con A. urinae isolato dal sangue,6 corrispondente a 0,5 pazienti/anno/1 milione di abitanti, e lo 0,8% degli episodi di endocardite infettiva.8 Gli episodi batteriemici/setticemici hanno risposto bene al trattamento con β-lattamici da soli o in combinazione con un aminoglicoside, a meno che la batteriemia fosse complicata da endocardite, in questi casi cinque dei sei pazienti sono morti. In un paziente A. urinae potrebbe, all’autopsia, essere cresciuto dalle valvole, nonostante il trattamento antibiotico apparentemente rilevante. Pertanto, il trattamento ottimale dell’endocardite da A. urinae deve essere determinato.

I test degli isolati di A. urinae con metodi di diffusione su tavoletta/disco hanno rivelato la suscettibilità a un’ampia gamma di agenti antimicrobici, compresi gli antibiotici β-lattamici e non β-lattamici.5,6,12 Poiché gli isolati di A. urinae sono stati principalmente associati alle infezioni del tratto urinario, è degno di nota che i ceppi sono stati trovati resistenti ai sulfamidici e ad altri antimicrobici utilizzati per il trattamento delle infezioni del tratto urinario, tra cui il cotrimossazolo, il trimetoprim, l’acido nalidixico e le polimixine.2,5,6,12 Recentemente, la suscettibilità di due isolati di A. urinae da pazienti affetti da endocardite è stata studiata con le MIC di sette antibiotici e sono state eseguite curve time-kill per la penicillina in combinazione con gentamicina o netilmicina.11 Il presente studio caratterizza ulteriormente il modello di suscettibilità di 56 isolati di A. urinae di varie origini geografiche. Sono state determinate le MIC di 14 antibiotici e, per due isolati, sono stati eseguiti esperimenti di curve time-kill con penicillina, gentamicina e vancomicina, da sole o in combinazione, al fine di ottenere maggiori informazioni sui regimi di trattamento ottimali delle infezioni gravi causate da A. urinae.

Materiali e metodi

Strains

Cinquantasei isolati clinici epidemiologicamente non correlati di A. urinae, comprendenti 42 isolati danesi (17 isolati di sangue e 25 isolati di urina) e 14 isolati di urina non danesi: uno dai Paesi Bassi (gentilmente fornito da P. J. G. M. Rietra), quattro dalla Svezia (gentilmente forniti da E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) e sette isolati nordamericani (gentilmente forniti da R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di riferimento: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 e Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Agenti antimicrobici

Sono stati utilizzati i seguenti agenti antimicrobici: benzilpenicillina (Leo, Ballerup, Danimarca); cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA); amoxicillina, ceftriaxone, eritromicina, amikacina, gentamicina, netilmicina, rifampicina, vancomicina (Sigma, St Louis, MO, USA); ossitetraciclina (Rosco, Taastrup, Danimarca), piperacillina (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloxacina (Bayer, Leverkusen, Germania); e sparfloxacina (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Francia).

Determinazione della MIC

A causa della crescita fastidiosa di A. urinae le condizioni del test hanno dovuto essere modificate rispetto alle raccomandazioni standard per eseguire le determinazioni della MIC (ad esempio, integrazione del 5% di sangue nell’agar e incubazione in atmosfera CO2 al 5% per 48 ore).13-15 Le MIC sono state determinate con il metodo di diluizione in agar. Sono state preparate diluizioni seriali di due volte di agenti antimicrobici in agar Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Germania) integrato con il 5% di sangue di cavallo lisato. Gli antibiotici sono stati testati da 0,008 a 512 mg/L, ad eccezione di amoxicillina (0,032-256 mg/L), rifampicina (0,008-32 mg/L) e ossitetraciclina (0,008-2 mg/L). Gli inoculi di 107 cfu/mL (104 cfu/spot) sono stati preparati da colture di agar overnight e sospesi in 0,9% NaCl, e sono stati applicati con un inoculatore multiplo a 21 punti (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). I risultati sono stati letti dopo l’incubazione per 2 giorni a 37°C in 5% CO2. La MIC è stata letta come la concentrazione più bassa che mostra la crescita di un massimo di tre colonie.

Indagini sulla curva time-kill

Sono stati esaminati due degli isolati di sangue testati (B1 e B8), entrambi provenienti da pazienti con endocardite. I ceppi sono stati testati contro la penicillina (MIC 0,125 e 0,6 mg/L, rispettivamente), la gentamicina (MIC 256 e 64 mg/L, rispettivamente) e la vancomicina (MIC 0.5 e 1 mg/L, rispettivamente) nelle seguenti concentrazioni clinicamente ottenibili: penicillina 2 × e 10 × MIC (P2 e P10, rispettivamente); vancomicina 4 × e 10 × MIC (V4 e V10, rispettivamente); gentamicina 10 mg/L (G10); e le combinazioni penicillina + gentamicina e vancomicina + gentamicina nelle seguenti concentrazioni: P2G10, P10G10, V4G10 e V10G10, rispettivamente. A t = -1 h le colonie fresche cresciute durante la notte sono state sospese a circa 105 cfu/mL in provette con brodo Todd-Hewitt preriscaldato. Le provette sono state poste in un bagno d’acqua a 37°C. A t = 0 h gli antibiotici, preparati immediatamente prima del test, sono stati aggiunti alle provette in duplicato. Tre provette senza antibiotici sono state usate come controllo della crescita. Campioni in duplicato sono stati prelevati a 0, 3, 6 e 24 ore da ogni provetta. I campioni sono stati diluiti serialmente e piastrati. Il numero di colonie sopravvissute è stato contato dopo un’incubazione notturna a 37°C in aria ambiente in sacchetti di plastica insieme a carta velina bagnata. Utilizzando campioni da 20 μL il numero minimo di batteri contati era di 50 cfu/mL. L’effetto di carry-over è stato eliminato per gli esperimenti penicillina-gentamicina aggiungendo 100 μL 100 000 U/mL di penicillinasi ad ogni piastra. Per gli esperimenti vancomicina-gentamicina l’effetto carry-over è stato eliminato per diluizione. Un’indagine pilota ha dimostrato l’effetto carry-over nel campione 100 ma non nel campione 10-1, gli ufc sono stati quindi contati utilizzando 200 μL dei campioni 10-1 dando ancora un limite di rilevamento di 50 ufc/mL. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno due volte in giorni diversi. L’attività battericida è stata definita come una riduzione dell’inoculo di almeno il 99,9% entro 24 ore. Sinergia (S), effetto additivo (A) e antagonismo sono stati definiti come: >2 log in più di uccisione (S), >1 e <2 log in più di uccisione (A) e >2 log in meno di uccisione, rispettivamente, per la combinazione rispetto al migliore dei singoli antibiotici.

Risultati

Determinazione MIC

Le MIC ottenute per i 56 isolati sono riportate nella tabella. Utilizzando i breakpoint per gli streptococchi raccomandati dall’NCCLS14,15 o dallo Swedish Reference Group of Antibiotics (SRGA),16,17 gli isolati erano suscettibili alle penicilline, mentre una suscettibilità ridotta è stata trovata per le cefalosporine testate. Le MIC per gli aminoglicosidi indicavano una suscettibilità ridotta per quasi tutti gli isolati. Tuttavia, la resistenza agli aminoglicosidi di alto livello (cioè gentamicina > 1000 mg/L) non è stata trovata per nessuno degli isolati. Tutti gli isolati erano suscettibili alla vancomicina. La rifampicina è stata il farmaco più attivo testato con una MIC50 di 0,031 mg/L (range <0,004-0,064 mg/L), ad eccezione di un isolato con una MIC > 32 mg/L (test ripetuti). Le attività dei chinoloni ciprofloxacina e sparfloxacina sono state trovate ugualmente buone.

Esami delle curve di uccisione

Le curve di uccisione medie per ogni esperimento sono presentate nella figura. La vancomicina da sola (sia 4 × che 10 × MIC) ha mostrato attività battericida contro il ceppo B1. Per la penicillina, l’attività battericida è stata trovata solo per 10 × MIC contro B8. Per entrambi gli antibiotici l’effetto battericida era lento, cioè appariva per la prima volta dopo 24 ore. La gentamicina non era battericida – nella maggior parte degli esperimenti si è vista la crescita. La penicillina in combinazione con la gentamicina era sinergica ed era rapidamente battericida per il ceppo B8 sia in P2G10 che in P10G10. Per il ceppo B1, tuttavia, è stato trovato solo un effetto battericida additivo e lento. Quando si combina la vancomicina con la gentamicina è stato trovato un rapido effetto battericida per entrambi i ceppi. Un effetto sinergico era rilevabile dopo 3 ore e 6 ore per il ceppo B8. A 24 ore, tuttavia, l’attività omicida della vancomicina era così pronunciata che non è stato possibile rilevare un effetto sinergico. Per B1 è stato trovato solo un effetto additivo. Nessun effetto antagonista è stato registrato in nessuno degli esperimenti.

Discussione

Questo studio presenta per la prima volta una valutazione delle MIC di un pannello rappresentativo di antibiotici contro un gran numero di isolati di A. urinae ottenuti da pazienti con infezione del tratto urinario, batteriemia/septicemia e/o endocardite. Per valutare l’uso degli antibiogrammi a fini tassonomici, le MIC di 15 antibiotici per 10 ceppi di A. urinae sono state esaminate in precedenza,12 ma non sono stati presentati dati dettagliati.

A. urinae sono organismi fastidiosi che richiedono un’integrazione di sangue nei media e talvolta un’incubazione in un’atmosfera arricchita di CO2 e/o un periodo di incubazione prolungato per ottenere una crescita sufficiente per testare la suscettibilità agli antibiotici. Pertanto, i ceppi non potevano essere testati utilizzando le condizioni standard descritte dal BSAC o dal NCCLS.13-15 La necessità di modificare le condizioni di coltura è, tuttavia, un problema comune per i batteri Grampositivi fastidiosi.18,19 Gli isolati di A. urinae hanno mostrato un modello di suscettibilità antimicrobica simile a quello degli streptococchi α-emo-litici con solo piccole variazioni di suscettibilità inter-isolate. Le MIC dei β-lattamici per gli isolati erano tipicamente entro quattro passi di diluizione di due volte, tranne che per le cefalosporine ceftriaxone e cefepime, che hanno mostrato una maggiore variazione di MIC (tabella). A causa della possibile influenza dell’incubazione con CO2 (abbassamento del pH), bisogna prestare attenzione nel giudicare la suscettibilità alla tetraciclina (suscettibilità sovrastimata) e all’eritromicina (suscettibilità sottostimata). Tra gli isolati di A. urinae esaminati, non è stata identificata alcuna resistenza di alto livello contro gli aminoglicosidi testati, lasciando aperta la possibilità di un effetto sinergico quando combinato con un β-lattamico o una vancomicina (vide infra). Come giudicato dalle MIC, esistono diverse alternative di trattamento per le infezioni gravi, poiché gli isolati erano suscettibili alle penicilline, alla vancomicina e alla rifampicina (tranne un isolato). Anche i chinoloni selezionati, ciprofloxacina e sparfloxacina, hanno mostrato una buona attività. Sebbene sia un organismo fastidioso, i risultati ottenuti con i metodi di diffusione del disco2,5,20 sono stati in accordo con le MIC presentate in questo studio, suggerendo che un risultato affidabile può essere ottenuto usando questi metodi di suscettibilità di routine.

Le linee guida per il trattamento di infezioni gravi come la setticemia con o senza endocardite dovrebbero essere basate in modo ottimale sull’esperienza clinica in studi attentamente progettati, ma questo è difficile quando si tratta di batteri rari. Pertanto, gli studi in vitro che includono tecniche di curva di uccisione possono fornire informazioni importanti per il clinico in questi casi.

Per gli esperimenti sono state scelte concentrazioni antibiotiche raggiungibili in vivo. Per la gentamicina è stata scelta una dose di 10 mg/L, corrispondente alla concentrazione ottenuta con un dosaggio di 240 mg una volta al giorno (equivalente a 3-4 mg/kg).21 Inoltre, sebbene diversi articoli sostengano il dosaggio due volte al giorno per l’endocardite, in Danimarca la gentamicina una volta al giorno è comunemente usata, grazie alla riduzione della nefrotossicità e al fatto che l’effetto sinergico con gli antibiotici β-lattamici aumenta all’aumentare delle concentrazioni di aminoglicoside.22 I dati ottenuti nel nostro studio in vitro delle curve di uccisione per la penicillina e la vancomicina hanno mostrato che né la penicillina né la vancomicina erano battericidi contro nessuno dei due isolati testati da pazienti con endocardite infettiva. Quando combinato con la gentamicina, un effetto battericida è stato ottenuto contro entrambi gli isolati sia per la penicillina che per la vancomicina. Fortunatamente, questi regimi sono raccomandati per il trattamento dell’endocardite infettiva di eziologia sconosciuta in tutto il mondo.23 I tassi di uccisione dei due ceppi erano diversi, indicando che possono esistere variazioni tra i ceppi. Nonostante la suscettibilità in vitro agli antibiotici somministrati, abbiamo riscontrato che la prognosi era scarsa per i pazienti anziani affetti da endocardite infettiva causata da A. urinae.8 I presenti risultati per penicillina, gentamicina e netilmicina (MIC) sono in accordo con quelli del recente rapporto svizzero di Zbinden et al.11 per due isolati di A. urinae da pazienti con endocardite.

Le opzioni di trattamento per A. urinae sembrano includere penicilline per casi meno gravi. Nei casi gravi, cioè l’endocardite, le indagini time-kill suggeriscono un beneficio della combinazione di penicillina o vancomicina con gentamicina. Nel paziente allergico alla penicillina la vancomicina rappresenta l’alternativa più ovvia.