Il test di Ames è un test biologico per valutare il potenziale mutageno dei composti chimici. Utilizza i batteri per testare se una data sostanza chimica può causare mutazioni nel DNA dell’organismo di prova. Il test è stato sviluppato da Bruce N. Ames negli anni ’70 per determinare se una sostanza chimica a portata di mano è un mutageno.
Obiettivo
Determinare l’attività mutagena delle sostanze chimiche osservando se causano mutazioni nei batteri campione.
Principio
- Il test di Ames utilizza diversi ceppi di batteri (Salmonella, E.coli) che portano una particolare mutazione.
- Mutazioni di punto sono fatte nell’operone dell’istidina (Salmonella typhimurium) o del triptofano (Escherichia coli), rendendo i batteri incapaci di produrre l’amminoacido corrispondente.
- Queste mutazioni danno luogo a organismi his- o trp- che non possono crescere a meno che l’istidina o il triptofano siano forniti.
- Ma coltivare la salmonella his- in un mezzo contenente certe sostanze chimiche, provoca una mutazione nel gene che codifica l’istidina, tale che essi riacquistano la capacità di sintetizzare l’istidina (his+). Questo per dire che quando si verifica un evento mutageno, sostituzioni di basi o frameshift all’interno del gene possono causare una reversione alla prototrofia aminoacidica. Questa è la mutazione inversa.
- Questi batteri invertiti cresceranno poi in mezzi carenti di istidina o triptofano, rispettivamente.
Il potenziale mutageno di un campione viene valutato esponendo organismi che richiedono aminoacidi a varie concentrazioni di sostanze chimiche e selezionando l’evento di inversione. Per questa selezione si usano mezzi privi dell’aminoacido specifico che permettono la sopravvivenza e la crescita solo delle cellule che hanno subito la reversione alla prototrofia istidina / triptofano. Se il campione di prova causa questa reversione, è un mutageno.
Metodo
I ) Isolare un ceppo auxotrofo di Salmonella Typhimurium per l’istidina. (es. His-ve)
II) Preparare una sospensione di test di his-ve Salmonella Typhimurium in un tampone semplice con la sostanza chimica di test (es. 2-aminofluorene). Aggiungere anche una piccola quantità di istidina.
Nota: una piccola quantità di istidina è necessaria affinché i batteri inizino a crescere. Una volta che l’istidina è esaurita, solo i batteri mutati per ottenere la capacità di sintetizzare l’istidina formano colonie.
III) Preparare anche una sospensione di controllo di Salmonella Typhimurium His-ve ma senza sostanze chimiche di prova.
IV) Incubare le sospensioni a 37°C per 20 minuti
V) Preparare le due piastre di agar e distribuire la sospensione sulla piastra di agar.
VI) Incubare le piastre a 37°C per 48 ore.
VII) Dopo 48 ore contare il numero di colonie in ogni piastra.
Interpretazione dei risultati
- La mutagenicità delle sostanze chimiche è proporzionale al numero di colonie osservate.
- Se c’è un gran numero di colonie sulla piastra di prova in confronto al controllo, allora tali sostanze chimiche sono dette mutagene.
- Si può vedere un numero molto basso di colonie anche sulla piastra di controllo. Questo può essere dovuto alla mutazione puntiforme spontanea sul gene che codifica l’isidina.
Usi
Mentre il test di Ames è usato per identificare le mutazioni reversibili che sono presenti nei ceppi, può anche essere usato per rilevare la mutagenicità di campioni ambientali come farmaci, coloranti, reagenti, cosmetici, acque reflue, pesticidi e altre sostanze che sono facilmente solubilizzate in una sospensione liquida.
Meriti
- Semplice, rapido e robusto saggio batterico.
- La facilità e il basso costo del test lo rendono inestimabile per lo screening di sostanze nel nostro ambiente per la possibile cancerogenicità.
- Il test di Ames può rilevare mutanti adatti in grandi popolazioni di batteri con alta sensibilità.
Limitazioni
- Alcune sostanze che causano il cancro negli animali da laboratorio (diossina, per esempio) non danno un test di Ames positivo (e viceversa)
- Il test di Ames consiste in ceppi di Salmonella typhimurium e quindi non è un modello perfetto per l’uomo.