Biological Aspects
L’attivazione dello zimogeno avviene per proteolisi limitata intra- o intermolecolare che elimina un propeptide inibitorio. Le propezie svolgono un ruolo importante come modulatori dell’attività della proteasi per garantire che l’enzima maturo si formi nel posto giusto e/o al momento giusto. Alcuni membri della peptidasi C1A sono sintetizzati con il segnale di ritenzione ER C-terminale KDEL che indirizza queste proteasi a vescicole litiche specializzate. La sequenza KDEL sembra agire sia come un dominio di targeting che per mantenere una forma inattiva. Inoltre, le granuline vegetali, che sono considerate come una sottoclasse della famiglia della papaina e sono anche coinvolte nella senescenza, includono una sequenza di estensione C-terminale con una regione ricca di Pro e un dominio granulinico con un’alta omologia alle proteasi animali della famiglia epithelin/granulin . Questo dominio simile alla granulina può anche partecipare alla regolazione della solubilità della proteasi e alla sua attivazione.
L’attività delle peptidasi C1A dipende anche dal pH, indicativo del compartimento in cui si localizzano e dalla presenza di regolatori di proteasi endogeni. La compartimentazione all’interno delle cellule fornisce un ulteriore livello di regolazione per cui le cellule vegetali contengono diversi tipi di organelli, ognuno con una funzione specializzata. I pro-enzimi inattivi sono sintetizzati nel lume del reticolo endoplasmatico (ER). Poi, attraverso la rete trans-Golgi sono infine trasportati nei vacuoli o secreti esternamente per raggiungere la proteina bersaglio da degradare. Inoltre, il trasporto di massa delle proforme delle peptidasi C1A con coda KDEL ai vacuoli di stoccaggio delle proteine tramite vescicole derivate dall’ER è stato riportato nella mobilitazione nei semi germinativi dicotiledoni. Il pH relativamente acido dei vacuoli fornisce le condizioni ottimali per l’elaborazione delle proteasi, poiché questi organelli non sono solo il sito dell’azione enzimatica ma anche della loro attivazione. Inoltre, le peptidasi C1A sono solitamente immagazzinate o appena sintetizzate in un tipo di cellula per avviare la degradazione delle proteine bersaglio in altri tipi di cellule. Per esempio, diverse proteasi simili alle catepsine L, H e B dell’orzo sono presenti nell’epitelio scutellare e nello strato aleuronico e vengono poi secrete nell’endosperma al momento della germinazione in risposta alla GA.
Studi recenti sulle C1A peptidasi vegetali hanno riguardato soprattutto analisi di geni basate sul sequenziamento dei genomi di molte specie di piante. Oltre alle analisi delle sequenze di aminoacidi e all’identificazione di nuovi membri della proteasi, devono essere fatte più ricerche a livello proteico per chiarire ulteriormente i ruoli fisiologici di questi enzimi. La partecipazione delle singole proteasi Cys alla degradazione delle proteine durante la senescenza e i processi di abscissione, la morte cellulare programmata, la maturazione dei frutti e l’accumulo e la mobilizzazione delle proteine di stoccaggio nei semi e nei tuberi sono stati pubblicati. Le proteasi C1A svolgono anche un ruolo essenziale nelle risposte di difesa locali e sistemiche contro patogeni e parassiti.
Per quanto riguarda il processo di germinazione, i semi fungono da riserve di amido, proteine e lipidi che vengono utilizzati durante la germinazione fino a quando la fotosintesi non è completamente stabilita. L’idrolisi delle riserve è un punto chiave che è compiuto principalmente da amilasi e proteasi, sia immagazzinate durante la maturazione del seme sia sintetizzate di recente durante la germinazione iniziale. I prodotti di degradazione sono poi assorbiti e utilizzati per lo sviluppo delle piantine. Le peptidasi C1A sono descritte come il gruppo più abbondante di proteasi responsabili della degradazione e della mobilizzazione delle proteine di stoccaggio nei semi delle specie monocotiledoni e dicotiledoni. La maggior parte delle ricerche sulla germinazione dei semi sono state fatte nei cereali, in particolare nell’orzo, dove la maggior parte degli eventi analizzati sono stati focalizzati a livello trascrizionale. Una complessa rete di geni che codifica molteplici fattori trascrizionali è stata descritta come geni coinvolti nel controllo dell’espressione delle idrolasi all’inizio della germinazione. Inoltre, l’attività della proteasi C1A sembra essere regolata a livello post-traslazionale dalle legumine, peptidasi cisteiniche Asn-specifiche coinvolte nell’elaborazione dei polipeptidi e nella ripartizione delle proteine. Zhang & Jones ha riportato che 27 proteasi cisteiniche erano tra le 42 proteasi coinvolte nella germinazione del seme d’orzo. Recentemente, un’analisi completa del trascrittoma della germinazione del grano d’orzo in due frazioni di tessuto (endosperma amidaceo/aleurone e embrione/scutello) ha mostrato l’induzione di un alto numero di geni C1A peptidasi durante la germinazione, la maggior parte dei quali sono mediati dalle gibberelline. Inoltre, diverse peptidasi simili alla catepsina L dell’orzo, diversamente espresse nei tessuti dei semi, sono state implicate nella mobilitazione delle ordeine, le principali proteine di stoccaggio dell’orzo. Allo stesso modo, i geni omologhi che codificano le proteasi C1A del grano partecipano alla degradazione delle proteine di massa dell’endosperma del grano durante la germinazione del seme e la successiva crescita delle piantine.
La mobilitazione dei composti immagazzinati nei semi delle dicotiledoni è anche principalmente mediata dalle peptidasi C1A, sebbene i loro modelli spaziali e temporali di espressione e attività differiscano notevolmente dalle monocotiledoni. Nei semi di legumi e di colza, le globuline sono le proteine di stoccaggio più abbondanti nel grano e sono mobilitate per la prima volta nell’asse embrionale durante la germinazione. Solo dopo che le riserve proteiche sono esaurite nell’asse, la maggior parte delle globuline viene mobilitata nei cotiledoni dopo la germinazione. Altre peptidasi cisteiniche, come le legumine, sembrano essere essenziali nella scissione endoproteolitica della mobilitazione delle proteine di stoccaggio nell’asse embrionale e nei cotiledoni in diverse specie di legumi. Il ruolo delle legumine è stato dimostrato anche negli eventi di deposizione e mobilitazione delle 11S globuline dei cotiledoni di veccia e grano saraceno durante la germinazione dei semi. Recentemente, Wang et al. hanno dimostrato che le legumine sono anche enzimi essenziali nella maturazione delle gluteline del riso, che costituiscono fino all’80% delle proteine totali dell’endosperma nel riso.
La senescenza è un processo strettamente controllato durante lo sviluppo della pianta che può essere modulato da fattori e stress endogeni ed esogeni. È caratterizzata dallo smantellamento dell’organizzazione dei tessuti e da un’efficiente mobilitazione e trasferimento di sostanze nutritive da vecchie foglie, petali e altri organi ai tessuti sink (tuberi, semi di cereali, frutti) per sostenere un’ulteriore crescita e sviluppo. Sono state descritte diverse peptidasi C1A coinvolte nella senescenza in diversi tessuti e specie: petali di Dianthus caryophyllus L. e Alstroemeria, foglie di grano e Arabidopsis, buccia di arancia, tra gli altri. Nei tessuti in senescenza del ricino, del daylily e del fagiolo mung, la propeptidasi a coda di castoro KDEL è il componente principale nella matrice di un organello speciale (ricinosoma o vescicola proteasi precursore) che germoglia dall’ER. È stato ipotizzato che l’accumulo di questa peptidasi rilasciata da questi organelli sia necessario per le ultime fasi della senescenza. Inoltre, il silenziamento antisenso della proteasi Cyp15a (classificata come peptidasi simile alla catepsina F) ha portato a fenotipi di senescenza ritardata in Medicago truncatula. Le piante di tabacco transgeniche che esprimono la cistatina di riso OC-I, un inibitore della cisteina peptidasi, sono cresciute più lentamente dei controlli e hanno mostrato cambiamenti nel contenuto proteico delle foglie con un aumento dell’abbondanza, tra gli altri, di due isoforme di Rubisco attivasi, insieme a una senescenza ritardata. Così, secondo questi autori, Rubisco è probabilmente un obiettivo principale di cisteina peptidasi durante la senescenza e meccanismi di interazione attraverso la degradazione vacuolare di Rubisco-contenuto vescicole. Allo stesso modo, l’accumulo di cisteina peptidasi nei vacuoli associati alla senescenza, con un’intensa attività proteolitica, è stato osservato nelle foglie senescenti di soia e tabacco Arabidopsis. In parallelo, è stata determinata una costante diminuzione dei livelli di Rubisco, indicando il ruolo di queste proteasi nella degradazione della clorofilla durante la senescenza. Inoltre, i risultati dei precursori delle peptidasi simili alla papaina insieme alle pro-legumine nei corpi ER di selezione delle proteasi delle cellule epidermiche dell’Arabidopsis indicano che entrambi i tipi di proteasi cisteiniche contribuiscono in modo cooperativo alle risposte allo stress, come fanno per la mobilitazione delle proteine di stoccaggio durante la germinazione dei semi.
Le peptidasi C1A svolgono anche ruoli cruciali nelle interazioni tra patogeni vegetali e parassiti. Diversi rapporti hanno dimostrato che le piante utilizzano le peptidasi C1A per proteggersi contro diversi parassiti. La papaina è un componente del lattice della papaia coinvolto nella difesa dell’albero della papaia contro diversi bruchi lepidotteri. Mir1 è una proteasi C1A del mais indotta in risposta al verme erbivoro Spodoptera frugiperda. Una volta ingerita, l’attività proteolitica di Mir1 danneggia la matrice peritrofica dell’insetto, compromettendo l’utilizzo dei nutrienti. Allo stesso modo, le proteasi C1A sono utilizzate nei processi difensivi contro i patogeni delle piante. I geni della catepsina B dell’Arabidopsis sono coinvolti nella risposta ipersensibile e sono richiesti per la resistenza basale completa contro il patogeno batterico virulento Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Gli effettori apoplastici secreti da due patogeni vegetali eucarioti non correlati, il fungo Cladosporium fulvum e l’oomicete Phytophthora infestans, mirano alla difesa del pomodoro C1A Cys peptidasi Rcr3. Questi effettori sono inibitori della cisteina proteasi simili alla cistatina, che supportano il ruolo importante che l’interazione tra gli enzimi C1A e le fitocitatine gioca nella difesa delle piante.