10-200kDのタンパク質バンドを検出するには、アクリルアミド含有率6％から15％の標準的なタンパク質ゲルが一般的に使用されてきた。 この方法では、より大きなタンパク質は検出できないため、研究者たちは、従来とは異なる2%ゲルを用いて、見かけ上の移動度が極めて低い、新しい巨大タンパク質を発見したのは、わずか20年前のことである。 この新しいタンパク質、タイチン1（コネクチン2とも呼ばれる）の分子量は、それまで1.2-3.0 MDと推定されていた（レビューについては、参考文献3および4参照）。 SDSゲル上のタイチンのバンドの強度を他の筋原線維タンパク質のそれと比較すると、タイチンはミオシン、アクチンに次いで3番目に多い筋タンパク質で、筋タンパク質総量のおよそ10％を占めているようである。 体重80kgの成人の場合、約0.5kgのタイチンが含まれていることになる。
1980年代には、タイチン特異的抗体を用いた電子顕微鏡研究により、タイチンが筋原線維の不可欠な部分であることが証明された。 1980年代、チチン特異的抗体を用いた電子顕微鏡の研究により、チチンが筋原線維の不可欠な部分であることが証明されました。チチン単一分子は、ZディスクからM線まで伸びており、厚いフィラメント（主にミオシン）と薄いフィラメント（主にアクチン）とは別の、第三のサルコマーフィラメントシステムを形成しています5。 これは、タイチンのペプチド鎖が主にIg様反復配列とFN3様反復配列からなり、球状ドメインを形成し、タイチン分子のほぼ90%の質量を占めているためである（図1）。 Aバンドでは、これらの反復配列は高度に秩序だったパターンを形成し、他のAバンドタンパク質、特に軽メモリヨシンやCタンパク質と規則正しい間隔で結合し、太いフィラメント構造の編成に役立っている（総説は文献15を参照）。 シックフィラメントタンパク質との緊密な結合により、タイチンのAバンド部分は生理的条件下で機能的に硬くなっている。 タイチンフィラメントがサルコメアから抜き取られたり、放射線やプロテアーゼで分解されると、弛緩した筋原繊維の硬さは減少する（総説は文献3、4参照）。 1819
ヒト骨格筋および心筋のタイチンのcDNA配列が決定された後、筋構造と弾性におけるタイチンの役割を調べる分子レベルのアプローチが容易になった8。 骨格筋と心筋のタイチンのSDSゲル上での移動度の違いから示唆されたように、タイチンは様々な筋組織で異なるアイソフォームで発現していることが明らかになった。8 例えば、ヒト心筋タイチンは82kbの巨大mRNAによってコードされており、27000残基のペプチド（Mr、2993kD）をコードする81kbのオープンリーディングフレームを含んでいる。 一方、ヒトのヒラメ筋タイチンは、分子量≈3700 kDと、かなり大きなポリペプチドである。 8
タイチンの弾性
筋繊維が伸展すると収縮する力が生じ、これは受動張力または静止張力（硬さ）と呼ばれる。 心筋は骨格筋よりはるかに硬いことが以前から知られていた。 以前は、心筋組織の高い受動的剛性は、主にコラーゲンなどの細胞外構造の低いコンプライアンスから生じると考えられていたが22、単一筋細胞調製法の出現により23、剛性構造は少なくとも部分的に、細胞内に存在する必要があることが明らかになった2425 筋組織の過伸張を防止するのに役立つ剛性細胞外要素は、より極度のストレス時にのみ見出される可能性がある。 最近、弛緩した単体の筋原繊維を伸ばすと、かなりの受動力が発生することが証明され、心臓の標本は骨格標本よりもおよそ一桁硬いことがわかりました。19 これらの硬さの違いは、現在、タイチンの異なる長さの変異体の筋タイプ特異的発現から、より正確には、Iバンドにおける二つの異なるタイチンモチーフ家族の発現の差から生じることがわかっています（図1）813モチーフタイプの一つは、タンジムに配列したIgドメインによって表されています。 脊椎動物の最も硬い筋である心臓では、40個のタンデムIgドメインが発現しているのに対し、はるかに柔軟なヒラメ筋では、93個のタンデムIgドメインが発現しています。 もう一つの発現量の異なるI-バンドタイチンセグメントは、プロリン、グルタミン酸、バリン、リジン残基がその配列の約70％を占めることから、PEVKドメインと呼ばれる独特のモチーフタイプである8。 このPEVKドメインは心臓で最も短く、骨格筋では非常に長い。ヒトの心臓のPEVK領域は163残基からなるのに対し、ヒトのヒラメ筋のPEVK領域は約2200残基ある（図1）8
タイチンのPEVK領域とタンデムIg領域の発現に差があることが判明し、筋線維弾性に対するこの二つの異なるIバンドセグメントの相対寄与を確認する必要性が生じた。 このような同定は、最近、伸展した単一筋原繊維13や筋繊維14の受動的張力応答を測定するとともに、選択したIバンドタイチン抗体エピトープの位置をモニターすることによって試みられた（図2；文献13と比較）。 13142728 この最初の伸展は、受動的張力の増大が小さい（心筋）、あるいは無視できる（骨格筋）だけ202125 と相関しており、熱力学的に安定なドメインに独立して折れることが示されているタンデムIg モジュールのアンフォールドによってもたらされたのではない可能性があります9 。 中程度から長時間の伸展では、少なくとも骨格筋原線維では、主な伸展はPEVK領域で起こるようです1314が、受動張力は着実に増大しています（図2）。 心臓の筋原線維では、短いPEVK領域8も受動張力を支えるが、その程度は限定的である（図2の凡例と比較）。 PEVK領域の伸展性がなくなると，受動的張力は主にIgドメインの展開によって決定されるかもしれない2728；しかし，心筋の最大長は生体内で約2.4μmを超えないので，生理的条件ではそのような展開は起こりそうにない13
結論として，PEVK領域の高い伸展性1314は，このドメインが伸びたポリペプチド鎖にほぐれることができることを示している． 従って，タイチンのPEVK領域とタンデム-Igドメインは直列に作用する2つのバネシステムを構成している可能性がある． この2つのバネが異なる長さの変異体において組織特異的に発現していることが、筋の受動的力学特性がこれほど多様である理由を説明できるようになった。 一方、PEVKに富む配列のスプライシングの差は、弛緩した筋肉組織の特徴的な硬さを制御しているのかもしれない。 現在、重要な課題は、タイチンのPEVK領域が、筋原繊維の受動張力と弾性を決定する大規模かつ迅速な可逆的構造変化を起こすのはどの3次構造によるものかを明らかにすることである。
筋細胞生物学におけるタイチンの新たな役割
現在、どの細胞シグナル伝達装置が、筋形成および成長中の巨大タイチンポリペプチドの翻訳、組み立て、さらに分解およびターンオーバーを制御するのかは不明である。 タイチンには、ミオシン、Cタンパク質、M線タンパク質に対する数百の結合部位があり715、おそらくまだ同定されていない相当数のZ-diskおよびI-bandタンパク質に対する結合部位があると思われる。 では、筋細胞はどのようにして27000-33000残基のタイチンペプチドの翻訳を制御しているのだろうか？また、どのようにしてタイチンの合成と筋形成中のタイチンリガンドの集合が緊密に連動しているのだろうか？ 魅力的なモデルは、タイチン、ミオシン、およびC-タンパク質のmRNAが共局在化し、共翻訳的に組み立てられることで、新生ペプチド鎖が生体内で見られるパラクリスタルオーダーのタンパク質メッシュワークに追い込まれるというものである29。 明らかに、タイチン／太いフィラメント超分子集合体がどのようにして高度に秩序だった3次元網目構造を構成することができるのかについて、より良い理解は、発現したタイチン、ミオシンおよびCタンパク質断片の生化学的特性評価と、おそらくタイチンのmRNA代謝の研究によって得られるに違いない。 タイチンのC-末端近くにあるユニークな配列挿入の1つはセリン・スレオニンキナーゼドメインをコードしている（図1）7。このドメインと隣接するIgおよびFN3反復配列は巨大無脊椎動物タンパク質であるトゥイッチンおよびプロジェクチンのドメインと非常に似ている3334。 最近、軟体動物アプリシアのツイッチンキナーゼが、ユビキタスカルシウム制御補因子S100を介して数桁の活性化を示すことが示された37。したがって、ツイッチンフィラメント（おそらくタイチンフィラメントも）は、筋肉における新しいカルシウム感受性フィラメントシステムであると思われる。 タイチン／ツイチンキナーゼの活性を人工基質上で制御する因子についての知見は高まっているが、これらのキナーゼの真の基質（したがってその生理的役割）は依然として不明である。 タイチンの組立／分解の生理を分子レベルでよりよく理解するには、タイチン上のカルパイン蛋白質酵素p94，16に対する特定の結合部位の発見が重要である（図1との比較）。 すべての細胞種に発現しているユビキタスカルパインとは対照的に、p94は筋肉組織にのみ発現している。 p94を餌にした酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、タイチンフィラメント上に2つの異なるp94結合部位が同定された16。 おそらく、この部位でp94またはp94が制御するプロテアーゼがチチンを切断することが、チチンが容易に分解されていわゆるT2チチン（またはβ-コネクチン）になる理由を説明しているのだろう3。 さらに、タイチンのp94に対する2番目の結合部位は、フィラメントのC末端にあり、タイチンの最後のユニークな配列挿入部と一致している（図1）。 なぜ、タイチンに少なくとも2つの異なるp94結合部位が存在するのかは不明であるが、可溶性p94は極めて急速に分解され、半減期が30分であることから、タイチンのp94結合部位がカルパインプロテアーゼを複合体の安定化状態に隔離する機能を持つのではないかと思われる。 興味深いことに、タイチンのC-末端のp94結合モチーフは、筋組織によってはスプライシングの差によってスキップされている38。このことは、p94とタイチンの相互作用にさらなる複雑さを与え、タイチンの安定性を組織特異的に制御している可能性を提起している。 最後に、タイチンフィラメントとp94または他のカルパインプロテアーゼとの間の相互作用の分子理解は、筋肉の変性と再生について、特に病態生理に関連してより完全に理解できるようになる可能性がある。 正常な筋ジストロフィー患者の筋生検に含まれるタンパク質を注意深く調査したところ、DMD と FCMD ではタイチンが分解されていることがわかりました39 。 タイチンは p94 と特異的な結合部位を持っていることから、FCMD、DMD、LGMD-2A などの遺伝的に異なる筋ジストロフィーでは、p94 とタイチンの相互作用に異常があり、その結果、タイチンフィラメント系が病理的にもろくなり、共通の第二病態として発症するという興味深い可能性が提起された。 Aバンドの規則正しいチチン構造が秩序あるサルコメア形成に重要であると思われる一方、Iバンドのチチンの伸縮性が筋原繊維の受動的な力学特性を決定することが明らかである。 将来的には、生物物理学的手法と分子生物学的手法を組み合わせたアプローチによって、Iバンドのタイチンの弾性特性の分子的理解が進むかもしれない。 また、タイチンのキナーゼ活性やシグナル伝達における役割については、さらなる詳細な解明が待たれるところである。 最後に、タイチンの病態生理への関与をさらに明らかにするためには、発現したタイチンモジュールが他の筋原線維や細胞質タンパク質と相互作用する可能性を調べ、分子レベルでそれらの相互作用を機能的に特徴づけることが必要であろう。 福山- Fukuyama- Duchenne muscular dystrophy Duchenne muscular dystrophy Immunoglobulin 四肢帯状筋ジストロフィー2A型 図1.セリン/プロリンジペプチドの構造 タイチンフィラメントのドメイン構造およびサルコメアレイアウト。 100kbのmRNAから予測されるヒトヒラメタイチンのドメイン構造を示している。 3.7-MDのヒラメ筋タイチンペプチドには、IgおよびFN3スーパーファミリーのメンバーである100残基の反復配列が297コピー含まれている。9 エピトープマッピングしたタイチン特異的抗体を用いた免疫電子顕微鏡法により、配列中のどのセグメントがZディスク、Iバンド、AバンドおよびM線101112タイチンをコードしているかを推定することが可能であった。 タイチンのI-バンドセグメントには、タンデムに繰り返されるIgドメイン（タンデムIgタイチン）と、プロリン、グルタミン酸、バリン、リジン残基に富む「PEVKドメイン」が存在することが分かっている。 タイチンのタンデムIgとPEVK領域は、タイチンフィラメントのうち、生理的な伸張時に伸長する部分を表している。1314 Aバンドタイチンに特異的なのは、「スーパーリピート」と呼ばれるIgとFN3ドメインの規則正しいパターンである7 。これらのスーパーリピートは、ミオシンとCタンパク質に複数の構造的な結合部位をもたらす715 。 コードされたペプチドの中には、リン酸化モチーフ（Pi）とセリン／スレオニンキナーゼがある。 マッピングされたカルパインp94結合部位16を示す。 ドメインパターンの上の矢印は筋型特異的な代替スプライシングが起こる部位を示す8 図2. サルコメアの伸張に伴うタイチン伸張の現在のモデル。 伸縮性のあるタイチンセグメントを保有するIバンド部分を含むハーフサルコメアの主要部分を示している。 このタイチン配置のモデルは、腰筋の状況を反映し（Linkeら13, 1996より引用）、最近報告されたAバンドの端にあるMIRエピトープの位置も考慮している11。 弛緩した長さでは、I-バンドタイチンドメインはコンパクトな状態（A）であると考えられている。 少し伸びると、タンデム-Igドメインはまっすぐになるが、PEVK領域は少ししか伸びず、受動張力は非常に小さくなる（B）。 中程度の伸張では、Igドメインはほとんど伸びないが、PEVK領域がほぐれ、受動張力が安定的に増加する（C）。 極度に伸展したサルコメア（生理的サルコメア長範囲の上限に向かって）では、PEVKエレメントは最大限に解きほぐされ、Igドメインは大きく伸展する。受動張力は、それまで結合していたAバンドタイチンがIバンドに放出される前に最大となる（伸展限界）。 心筋のサルコメアでは、大きな受動的張力の増加が弛緩長のすぐ上に現れ、タンデム-Ig領域の伸長と相関しているようである2526。タイチン弾性の正確なメカニズムは、まだ解明されていない。 カラーコードは以下の通り：青：アクチン、緑：ミオシン、黄：タイチンのPEVK領域、赤：非PEVK領域。 塗りつぶした円はI-bandタンデム-Igモジュールを表す。 T12、N2-A、MIR、BD6は、単離した筋原繊維のI-バンドタイチンの伸長特性を測定するために使用したタイチン抗体の既知の結合部位である13。 9D10?は9D10抗体のエピトープと考えられる位置を示す。CおよびDの矢印の二重鎖は、エピトープがより長いサルコメアで広がったことを示す。 この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (La 668/2-3, Li 690/2-1), EUおよび “Forschungsfond der Fakulta¨t fu¨r Klinische Medizin Mannheim” によって支援されています。 また、J.C. Ru¨egg の継続的な支援に感謝する。 .Pathophysiological Aspects
Selected Abbreviations and Acronyms
DMD
=
Duchenne muscular dystrophy
FCMD
=
FN3
=
fibronectin type 3
Ig
=
LGMD-2A
=
SP
=セリン/プロリンジペプチド
Footnotes