Ames-test is een biologische test om het mutagene potentieel van chemische verbindingen te beoordelen. Hij maakt gebruik van bacteriën om te testen of een bepaalde chemische stof mutaties in het DNA van het testorganisme kan veroorzaken. De test werd in de jaren zeventig door Bruce N. Ames ontwikkeld om te bepalen of een bepaalde chemische stof mutageen is.
Doel
De mutagene werking van chemische stoffen bepalen door na te gaan of zij mutaties in monsterbacteriën veroorzaken.
Principe
- Ames-test gebruikt verschillende bacteriestammen (Salmonella, E.coli) die drager zijn van een bepaalde mutatie.
- Puntmutaties worden aangebracht in het histidine- (Salmonella typhimurium) of het tryptofaan- (Escherichia coli) operon, waardoor de bacterie niet in staat is het overeenkomstige aminozuur te produceren.
- Deze mutaties resulteren in his- of trp- organismen die niet kunnen groeien tenzij histidine of tryptofaan wordt geleverd.
- Maar het kweken van His- Salmonella in een medium dat bepaalde chemicaliën bevat, veroorzaakt mutatie in het histidine-coderende gen, zodanig dat zij weer in staat zijn histidine te synthetiseren (His+). Dit wil zeggen dat wanneer zich een mutagene gebeurtenis voordoet, basesubstituties of frameshifts binnen het gen een omkeer naar aminozuurprototerie kunnen veroorzaken. Dit is de omgekeerde mutatie.
- Deze omgekeerde bacteriën zullen dan groeien in media met respectievelijk een tekort aan histidine of tryptofaan.
Het mutagene potentieel van een monster wordt beoordeeld door organismen die aminozuren nodig hebben, bloot te stellen aan verschillende concentraties van de chemische stof en te selecteren op de omkeergebeurtenis. Voor deze selectie worden media zonder het specifieke aminozuur gebruikt, zodat alleen de cellen die de omzetting naar histidine/ tryptofaan-prototrofie hebben ondergaan, kunnen overleven en groeien. Als het testmonster deze omzetting veroorzaakt, is het een mutageen agens.
Methode
I ) Isoleer een auxotrofe stam van Salmonella Typhimurium voor histidine. (D.w.z. His-ve)
II) Bereid een testsuspensie van His-ve Salmonella Typhimurium in een gewone buffer met testchemicaliën (bv. 2-aminofluoreen). Voeg ook een kleine hoeveelheid histidine toe.
Notitie: kleine hoeveelheid histidine is nodig zodat de bacterie begint te groeien. Zodra de histidine op is, vormen alleen de bacteriën die gemuteerd zijn om histidine te synthetiseren kolonies.
III) Bereid ook een controlesuspensie van His-ve Salmonella Typhimurium, maar zonder testchemicaliën.
IV) Incubeer de suspensies gedurende 20 minuten bij 37°C.
V) Bereid de twee agarplaten en verdeel de suspensie over de agarplaten.
VI) Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37°C.
VII) Tel na 48 uur het aantal kolonies op elke plaat.
Interpretatie van de resultaten
- De mutageniteit van chemische stoffen is evenredig met het aantal kolonies dat wordt waargenomen.
- Als er een groot aantal kolonies op de testplaat is in vergelijking met de controle, dan wordt van deze chemische stoffen gezegd dat ze mutageen zijn.
- Ook op de controleplaat kunnen zeer weinig kolonies worden waargenomen. Dit kan het gevolg zijn van een spontane puntmutatie op het hisidine coderende gen.
Toepassingen
De Ames-test wordt weliswaar gebruikt om de in stammen aanwezige revertmutaties te identificeren, maar kan ook worden gebruikt om de mutageniteit van milieumonsters zoals geneesmiddelen, kleurstoffen, reagentia, cosmetica, afvalwater, pesticiden en andere stoffen die gemakkelijk in een vloeibare suspensie oplosbaar zijn, op te sporen.
Mogelijkheden
- Eenvoudige, snelle en robuuste bacteriële assay.
- Gemak en lage kosten van de test maken hem van onschatbare waarde voor het screenen van stoffen in ons milieu op mogelijke carcinogeniteit.
- Ames-test kan geschikte mutanten in grote populatie bacteriën met hoge gevoeligheid opsporen.
Beperkingen
- Sommige stoffen die bij proefdieren kanker veroorzaken (dioxine bijvoorbeeld), geven geen positieve Ames-test (en omgekeerd)
- Ames-test bestaat uit Salmonella typhimurium-stammen en is dus geen perfect model voor de mens.