Lecture Content
Introduction
De secretieroute in eukaryote cellen wordt gebruikt om eiwitten en lipiden naar het plasmamembraan en bepaalde membraangebonden organellen te sturen en om materiaal buiten de cel vrij te geven. Er zijn twee soorten secretie: constitutieve en gereguleerde. Constitutieve secretie is de standaardroute en wordt voornamelijk gebruikt om materiaal op het plasmamembraan en bepaalde membraangebonden organellen aan te vullen. Gereguleerde secretie eindigt in secretoire blaasjes die afgescheiden materiaal opslaan totdat een signaal fusie met het plasmamembraan teweegbrengt. Beide typen secretie gebruiken dezelfde route, maar signaalsequenties leiden de eiwitten naar de gereguleerde route. Cellen halen ook materiaal uit het plasmamembraan door middel van endocytose. Dit materiaal kan worden gerecycled naar het plasmamembraan of worden afgebroken in het lysosoom.
Beginselen van de secretorische route
Eiwitten en lipiden worden gesynthetiseerd in het ER en dan getransporteerd naar de Golgi. Eiwitten worden in het Golgi gesorteerd en naar het plasmamembraan, het lysosoom of de secretaire blaasjes gestuurd. Transport van eiwitten en lipiden tussen membraangebonden compartimenten vindt plaats via blaasjes die uit één compartiment komen en dan samensmelten met het volgende compartiment. Rabs, tethers en SNAREs verhogen de waarschijnlijkheid dat vesikels met het juiste doelmembraan fuseren. Cellen handhaven de integriteit en functionaliteit van het ER en Golgi door te voorkomen dat eiwitten in de vesikels terechtkomen en door de eiwitten die toch ontsnappen terug te halen.
Glycosylering
Glycosylering is de covalente binding van suikers aan eiwitten, die bij de meeste eiwitten in het ER plaatsvindt. Glycosylering helpt eiwitten te vouwen, richt eiwitten op specifieke organellen (b.v. lysosoom), en remt proteolyse. Bovendien worden veel eiwitten op het oppervlak van cellen en in de extracellulaire matrix die cellen omringt, zwaar geglycosyleerd voor diverse biologische doeleinden.
N-gekoppelde glycosylering vindt plaats in het ER en behelst de toevoeging van een groep van 14 suikers aan de aminegroep van asparagines. De groepen bevatten een mix van N-acetylglucosamine, mannose en glucose. De glucoseresiduen worden in de ER verwijderd voordat het eiwit naar de Golgi wordt getransporteerd. In de Golgi kunnen de suiker zijketens verder worden gemodificeerd door verwijdering en toevoeging van verschillende suikers.
O-linked glycosylation is de tweede vorm en omvat de toevoeging van suikers aan serines of threonines. O-gekoppelde glycosylering begint waarschijnlijk in de Golgi door de toevoeging van een enkele suiker. Andere enzymen voegen suikers toe in groepen van twee en de suiker zijketens kunnen extreem lang worden.
Het Golgi complex is een opeenstapeling van membraan cisternae met unieke biochemische samenstellingen. De cisternae worden gewoonlijk aangeduid als cis-, mediaal-, trans- en trans-Golgi-netwerk, waarbij eiwitten de cis binnenkomen vanuit het ER en verlaten vanuit het TGN. De cisternae blijken een unieke reeks enzymen te bevatten die de suikerzijketens op eiwitten wijzigen. Zo wordt mannose voornamelijk verwijderd in de mediale cisterna, terwijl galactose wordt toegevoegd in de trans cisterna.
Vesiculair transport
Transport tussen membraancompartimenten wordt gemedieerd door kleine vesikels. De vesikels bevatten een eiwitmantel die de vorming van vesikels aanstuurt en eiwitten in vesikels rekruteert. De vesikels worden naar het juiste compartiment geleid door een combinatie van Rab-eiwitten en SNARE’s. Rab’s zijn een grote familie van kleine GTP-bindende eiwitten, en elk membraancompartiment in de secretorische route blijkt een uniek Rab-eiwit te bevatten. SNAREs zijn eiwitten op vesikels en membraancompartimenten die paren om fusie te bewerkstelligen. SNAREs vormen een andere grote familie van eiwitten en verschillende compartimenten bevatten waarschijnlijk unieke SNARE eiwitten.
Vesicule Formation
Vorming van vesikels vanuit het ER is het duidelijkst begrepen en zal dienen als voorbeeld van hoe vesikels gevormd worden. Het mechanisme is waarschijnlijk vergelijkbaar voor andere compartimenten. Assemblage van een eiwitmantel stuurt de vorming aan en de assemblage van de mantel begint met de binding van het kleine GTP-bindende eiwit Sar1. Sar1-GTP associeert met ER en plaatst een kleine helix in het buitenste blad van de ER membraan bilayer om de kromming van het membraan te initiëren. Sar1-GTP recruteert twee andere reeksen eiwitten die samen de vesikelmantel vormen: het Sec23-Sec24 complex dat zich bindt aan ladingseiwitten en het Sec13-Sec31 complex dat helpt bij de vorming van het vesikel. Voor de selectie van de lading van de meeste eiwitten is een signaalsequentie nodig die een interactie aangaat met het Sec23-24 complex. Oplosbare eiwitten in het lumen van het ER associëren zich met ladingreceptoren die een signaalsequentie bevatten die Sec23-Sec24 bindt. Het mantelcomplex dat vesikels van het ER omgeeft, wordt COP II genoemd.
Targeting Vesicles to Correct Compartment
Twee reeksen eiwitten lijken te helpen vesikels te laten samensmelten met het juiste doelmembraan. De ene groep bestaat uit tethers die lokaliseren naar doelmembraancompartimenten en interageren met componenten van de vesicle coat. Verschillende tethers werden geïdentificeerd in cellen en elk lijkt zich te lokaliseren naar een verschillend compartiment. Tethers vormen structuren die zich uitstrekken van het membraan van het compartiment tot in het cytosol. Dit kan helpen bij de interactie tussen tethers en vesikels die aankomen uit het vorige membraancompartiment.
Een tweede reeks eiwitten die helpt bij het correct richten van vesikels op het juiste membraan zijn de SNARE’s. SNAREs bemiddelen ook bij de fusie tussen membranen. Vesikels bevatten één SNARE eiwit (vSNARE) en membraancompartimenten bevatten 2 tot 3 SNARE eiwitten (tSNAREs). SNARE-eiwitten op vesikels en membraancompartimenten interageren met specificiteit. Dierlijke cellen brengen 35 verschillende SNARE eiwitten tot expressie, maar slechts bepaalde sets van SNAREs interageren met elkaar. Door de SNARE’s te lokaliseren die alleen op vesikels en hun doelmembraan interageren, zorgen cellen ervoor dat vesikels met hun juiste doelmembraan fuseren.
Membraanfusie
SNARE-eiwitten bemiddelen fusie tussen vesikels en hun doelmembraancompartiment. SNARE-eiwitten bevatten lange gebieden die spiraalvormige structuren vormen. De spiraalvormige domeinen in vSNARE’s en tSNARE’s grijpen in elkaar en lijken te ritsen. De energie die vrijkomt door de volledige koppeling van vSNAREs en tSNAREs wordt verondersteld om fusie tussen het vesikelmembraan en het compartimentenmembraan te bewerkstelligen, hoewel het precieze mechanisme onduidelijk blijft.
Sommige vesicles dock aan hun doelmembraan maar fuseren niet. Afscheidingsblaasjes slaan bijvoorbeeld eiwitten en andere kleine moleculen op totdat de cel een signaal krijgt om ze vrij te geven. Sommige secretorische vesikels komen aan het plasmamembraan vast te zitten door interactie van vSNAREs en tSNAREs, maar de SNAREs worden verhinderd om volledig te koppelen om membraanfusie te bewerkstelligen. Signalen van buitenaf veroorzaken de opheffing van de remming van de koppeling, waardoor de vesikels met het plasmamembraan kunnen versmelten.
Proteïnesortering in het trans-Golgi-netwerk
Bij het bereiken van het trans-Golgi-netwerk worden de meeste eiwitten naar hun eindbestemming getransporteerd. De standaardroute lijkt transport naar het plasmamembraan te zijn, omdat het plasmamembraan voortdurend lipiden en eiwitten moet vervangen. Andere eiwitten worden gesorteerd naar lysosomen en secretieve blaasjes. Het signaal om een eiwit naar het lysosoom te sturen heeft te maken met de suikerzijketen. De meeste lysosomale eiwitten bevatten mannose-6-fosfaat, dat wordt toegevoegd in de cis-Golgi. De receptor die mannose-6-fosfaat bindt, bevindt zich in het trans-golgi-netwerk en rekruteert de manteleiwitten naar het trans-golgi-netwerk. Clathrine vormt de mantel rond deze blaasjes, en de blaasjes stapelen lysosomale eiwitten op alvorens uit het trans-golgi-netwerk af te breken. Deze blaasjes versmelten met endosomen. Het lumen van endosomen heeft een lage pH waardoor de mannose-6-fosfaatreceptor loskomt van lysosomale eiwitten. De mannose-6-fosfaatreceptor wordt teruggebracht naar het trans-Golgi-netwerk en het blaasje dat de lysosomale eiwitten bevat, rijpt uit tot een functioneel lysosoom.
Sommige eiwitten worden gesorteerd in secretorische blaasjes die deze eiwitten opslaan totdat de cel een signaal krijgt om ze vrij te geven. Het mechanisme waarmee eiwitten in secretoire blaasjes worden gesorteerd als deze eiwitten geen gemeenschappelijke sorteersignaalsequentie delen.
Endocytose
Cellen geven niet alleen materiaal af aan de externe omgeving, maar ze nemen ook materiaal op van buiten het plasmamembraan door middel van endocytose. Er zijn verschillende vormen van endocytose.
Phagocytose stelt sommige cellen (macrofagen, neutrofielen) in staat grote deeltjes zoals micro-organismen en dode cellen op te slokken en op te nemen. Bij fagocytose wordt het plasmamembraan rond het deeltje uitgestulpt. De uitdrijving wordt aangedreven door actinepolymerisatie. Het plasmamembraan omgeeft uiteindelijk het deeltje en versmelt om het volledig te omsluiten en een groot endocytisch blaasje te vormen.
Pinocytose vormt veel kleinere blaasjes (~ 100 nm) en stelt cellen in staat om kleine hoeveelheden extracellulaire vloeistof en delen van het plasmamembraan op te nemen. Eén vorm van pinocytose is clathrin-gemedieerde endocytose die cellen in staat stelt specifieke eiwitten van het celoppervlak op te nemen.
Clathrin-gemedieerde endocytose begint met de vorming van een put in het plasmamembraan. De put wordt aan de cytoplasmatische zijde omgeven door adaptoreiwitten die clathrine met de put verbinden. De adaptors interageren ook met eiwitten in het plasmamembraan die voor endocytose bestemd zijn. De put kan ~ 1000 eiwitten bevatten. Polymerisatie van clathrine leidt tot de vorming van een blaasje dat uiteindelijk loskomt van het plasmamembraan. Het GTPase dynamin katalyseert de afknijpreactie. De met clathrine beklede blaasjes versmelten met endosomen waar de lage pH liganden losmaakt van receptoren. Sommige eiwitten worden dan teruggevoerd naar het plasmamembraan, terwijl andere naar het lysosoom gaan waar ze worden afgebroken.