GyrB en GyrA expressie en zuivering
De sequentie die codeert voor het full-length E. coli GyrA (2-875) werd ingevoegd in een gemodificeerde pET28b die een N-terminale 10-His tag en een C-terminale Twin-strep tag bevat. De overexpressie werd uitgevoerd in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in LB-medium dat 50 µg/mL kanamycine en 35 µg/mL chlooramfenicol bevatte. Cellen werden geïnduceerd met 0,35 mM IPTG na het bereiken van een OD600 0,85 en eiwit werd uitgedrukt bij 37 ° C gedurende 4 uur. Cellen werden geoogst en geresuspendeerd in lysisbuffer (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% v / v glycerol, pH 8,0) en gelyseerd met drie cycli van hoge-druk-disruptie met behulp van EmulsiFlex-C3 bij 1500 bar. Het GyrA-eiwit werd gezuiverd door nikkel-affiniteitschromatografie op een met de hand gepakte XK 26/20-kolom (Pharmacia) met chelaatvormende sepharose 6 Fast Flow-hars (GE Healthcare), gebonden aan Ni2+ -ionen. De elutie werd uitgevoerd met de lysisbuffer die 250 mM imidazol pH 8,0 bevatte en de geëlueerde eiwitten werden rechtstreeks gehecht aan een 10 ml Streptavidine Sepharose (GE Healthcare). De eiwitten werden uitgebreid gewassen met Strep-buffer (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8,0) en geëlueerd met Strep-buffer die 3 mM Desthiobiotine (Sigma-Aldrich) bevat. Zowel 10-His tag als Twin-strep tag werden vervolgens gesplitst door PreScission protease (P3C) en Tobacco Etch Virus (TEV) splitsing (massaverhouding 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) overnacht bij 4 ° C. GyrA werd vervolgens verder gezuiverd door een anion exchange chromatografie stap met behulp van een HiTrap Q HP kolom (GE Healthcare). Het eiwit werd geëlueerd met een lineaire gradiënt van 20 kolomvolumes met buffer B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8,0). Fracties die GyrA bevatten werden gepoold en geladen op een Superdex S200 16/60 size-exclusion chromatografie kolom (GE Healthcare) met 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8,0. 37 mg GyrA werd verkregen uit 3 L culturen. De GyrB-coderingssequentie (2-804) werd in hetzelfde gemodificeerde pET28b ingevoegd. De overexpressie werd uitgevoerd in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in LB-medium met 50 µg/mL kanamycine en 35 µg/mL chlooramfenicol. De cellen werden geïnduceerd met 0,35 mM IPTG na het bereiken van een OD600 van 0,85 en het eiwit werd tot expressie gebracht bij 18 °C gedurende 18 uur. De GyrB-zuiveringsprocedure is zoals hierboven beschreven voor GyrA. 10 mg GyrB werden verkregen uit 3 L culturen.
Volledige DNA gyrase reconstitutie
E. coli GyrA en GyrB werden gemengd in equimolaire verhouding tot volledig DNA gyrase reconstitutie mogelijk te maken. Het complex werd verder gezuiverd op een Superdex S200 16/60 grootte-exclusie chromatografie kolom (GE Healthcare) met behulp van cryo-EM buffer (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 en Supplementary Fig. 1).
Nucleïnezuurbereiding
Een dubbel-nicked 180 bp DNA duplex werd gereconstitueerd met behulp van 2 gefosforyleerde asymmetrische synthetische oligonucleotiden 12 verkregen van Sigma-Aldrich (Supplementary Table 1). Kort gezegd werden de nucleïnezuren opgelost in DNA-se-vrij water bij 1 mM concentratie. Om de dubbelstrengs DNA te monteren, werd elke oligo gemengd bij 1:1 molaire verhouding, geanneed door incubatie bij 95 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens het verlagen van de temperatuur met 1 ° C elke 1 min tot het bereiken van 20 ° C. De annealed doublely nicked DNA duplex werd vervolgens gebufferd in Hepes 20 mM pH 8,0 met een BioSpin 6 kolom (BioRad).
Complexvorming voor cryo-EM
De gezuiverde DNA gyrase werd gemengd met de 180 bp dsDNA bij 1:1 molaire verhouding met een uiteindelijke eiwit-en DNA-concentratie van 32 µM. Het mengsel werd gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Gepotidacine (GSK2140944, aangekocht bij MedChemExpress), geresuspendeerd aan 10 mM in 100% DMSO, werd toegevoegd om een eindconcentratie van 170 µM (1,7% DMSO) te bereiken. Het mengsel werd gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd. AMP-PNP (Sigma) werd aan het complex toegevoegd in een eindconcentratie van 340 µM. Het volledig gereconstitueerde complex werd verder gedurende 30 min. bij 30 °C geïncubeerd. Tenslotte werd 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) aan het complex toegevoegd. Het monster werd gecentrifugeerd 2 uur bij 16.000 × g om mogelijke aggregaten te verwijderen.
Cryo-EM raster voorbereiding
Quantifoil R-1.2/1.3 300 mesh koperen roosters werden gloei-geladen gedurende 20 s voorafgaand aan de toepassing van 4 µl van het complex. Na 30 s incubatie werden de roosters ondergedompeld in vloeibare ethaan met behulp van een Vitrobot mark IV (FEI) met 95% kamervochtigheid bij 10 ° C.
Elektronenmicroscopie
Cryo-EM beeldvorming werd uitgevoerd op een Titan Krios microscoop bediend bij 300 kV (FEI) uitgerust met een K2 Summit directe elektronen camera (Gatan), een GIF Quantum energie filter (Gatan) bediend in nul-energie-verlies-modus met een spleet breedte van 20 e-V, een Volta Faseplaat (FEI) en een CS corrector (FEI). Beelden werden opgenomen in EFTEM nanoprobe-modus met Serial EM53 in super-resolutie telmodus bij een nominale vergroting van 130.000x met een super-resolutie pixelgrootte van 0,44 Å en een constante defocus doel van -500 nm (Supplementary Fig. 2c). De VPP werd geavanceerde naar een nieuwe positie om de 100 min (Supplementary Fig. 2b). Vier datasets werden verzameld met een dosistempo van 6 tot 8 e-/pixel/s (0,88 Å pixelgrootte op het preparaat) op de detector. Er werden beelden opgenomen met een totale dosis van 50 e-/Å2, een belichtingstijd van 7 tot 10 s en subframes van 0,2 tot 0,25 s (35 tot 50 totale frames). Een totaal van 11.833 films werden opgenomen na het verzamelen van gegevens van de 4 datasets.
Gegevensverwerking
Gegevensverwerking van elke dataset werd afzonderlijk gedaan volgens dezelfde procedure tot de 3D-verfijningen wanneer deeltjes werden samengevoegd. De super-resolutie dosis gefractioneerd subframes werden gain-gecorrigeerd met IMOD54 en tweemaal gekaveld door Fourier-cropping, drift-gecorrigeerd en dosis-gewogen met MotionCor255 opleveren gesommeerde beelden met 0,88 Å pixelgrootte. De contrastoverdrachtsfunctie van de gecorrigeerde microfoto’s werd geschat met GCTF v1.0656. Thon ringen werden handmatig geïnspecteerd op astigmatisme en microfoto’s met gemeten resoluties slechter dan 4 Å werden verwijderd, wat resulteerde in 8.701 resterende microfoto’s. Deeltjes werden automatisch geplukt door referentie-vrije Gaussian blob picking protocol in RELION 229,30. Samen de 4 datasets, een totaal van 1.572.962 deeltjes werden geselecteerd. Vier keer gepuncht deeltjes uit elke dataset werden afzonderlijk onderworpen aan twee rondes van 2D-classificatie in RELION 2 tot junk deeltjes en verontreinigingen te verwijderen wat resulteert in een totaal van 479.667 deeltjes voor verdere verwerking. Deeltjes uit de vier datasets werden samengevoegd tot een unieke dataset, gevolgd door een re-extractie met centrering in 3 × 3 verdeelde formaat. Een laatste ronde van 2D-classificatie werd vervolgens uitgevoerd, wat een uiteindelijke partikel stack van 338.616 deeltjes opleverde. De daaropvolgende deeltjesstapel werd onderworpen aan een ronde van 3D ab-initio classificatie in cryoSPARC31. Na het weggooien van de slechte kwaliteit modellen, de resterende ab-initio model resulteerde in een uiteindelijke dataset van 191.456 deeltjes, met een klasse waarschijnlijkheid drempel van 0,9 (Supplementary Fig. 2a). De ab-initio model werd laagdoorlaatfilter tot 30 Å en werd gebruikt als een referentie voor homogene verfijning in cryoSPARC wat resulteert in een 5,4 Å kaart. De verfijnde deeltjescoördinaten werden vervolgens gebruikt voor lokale CTF-schatting met behulp van GCTF v1.06, gevolgd door het opnieuw extraheren van 2 × 2 gekartelde deeltjes met centrering. Deze nieuwe deeltjes stack werd onderworpen aan een 3D auto-refinement in RELION2 met behulp van de ab-initio model laagdoorlaatfilter op 30 Å waardoor een kaart met een globale resolutie van 5,0 Å (Supplementary Fig. 3). De lokale resolutie varieerde van 4,0 Å in de DNA-bindende kern tot 9,0 Å in het ATPase domein en het GyrA β-speldwiel dat het DNA omsluit, wat duidt op een hoge flexibiliteit van deze twee modules. Om een uiteindelijke reconstructie van het volledige complex te verkrijgen met goed gedefinieerde dichtheden voor elk domein, voerden we 3D classificatie uit zonder uitlijning, wat verschillende klassen opleverde. Deeltjes uit drie klassen werden samengevoegd (94.633 deeltjes). De daaropvolgende 1 × 1 gebundelde deeltjesstapel werd verfijnd in RELION2 zonder masker tot late verfijning iteraties waar een zacht masker werd toegepast om de resolutie te verbeteren. Post-processing van de kaart leverde een 6,6 Å resolutie reconstructie van het totale complex (Supplementary Fig. 3).
Een combinatie van verschillende lokale benaderingen werd gebruikt om verschillende conformaties te identificeren en om de lokale resolutie van elk domein te verbeteren. Aangezien het ATPase domein te klein was voor een 3D gerichte verfijning, voerden we eerst een gerichte 3D classificatie van het ATPase domein uit met een zacht masker en geen uitlijning in RELION2. Een klasse van 58.329 deeltjes met een goed gedefinieerde dichtheid van de ATPase domein werd geselecteerd, gevolgd door re-extractie van 1 × 1 gebundeld deeltjes opleveren deeltjes met een pixelgrootte van 0,88 Å / pixel. Om een nauwkeurige uitlijning van de deeltjes te vergemakkelijken, werd deze klasse verder verfijnd in RELION2 met behulp van een zacht masker rond het ATPase domein en het DNA-bindende / splitsing domein wat een 5,9 Å globale resolutie kaart (ATPase-Core) (Supplementary Fig. 3).
Tweede, voerden we een gerichte 3D-classificatie van de GyrA β-pinwheel met een zacht masker en geen uitlijning in RELION2. Er werd een klasse van 45.040 deeltjes met een goed gedefinieerde dichtheid van het GyrA β-pinwiel geselecteerd, gevolgd door een nieuwe extractie van 1 × 1 gebundelde deeltjes, wat deeltjes opleverde met een pixelgrootte van 0,88 Å/pixel. Deze klasse werd verder verfijnd in RELION2 met behulp van een zachte masker rond de β-pinwheel en de DNA-binding / splitsing domein wat resulteert in een 6,3 Å resolutie kaart (CTD-Core) (Supplementary Fig. 3).
Ten slotte werd een gerichte 3D auto-refinement uitgevoerd in RELION2 met behulp van een zachte masker rond de DNA-binding / splitsing domein. Post-processing van de kaart produceerde een 4,3 Å resolutie reconstructie van het DNA-binding/cleavage domein. Vervolgens werd een gerichte 3D classificatie van het DNA-bindende/cleavage domein uitgevoerd. Twee van de klassen toonden betere hoeknauwkeurigheden en verschillende gesloten (60.548 deeltjes) en pre-openende conformatie (53.655 deeltjes) van het DNA-bindende/cleavage domein. Deze twee klassen werden verder verfijnd in RELION2 door gerichte 3D-verfijning met een C2-symmetrie met behulp van 1 × 1 gekarteerde deeltjes en gaven reconstructies met een globale resolutie van 4,0 en 4,6 Å na de nabewerking, respectievelijk (Supplementary Fig. 3). De gesloten DNA-binding / splitsing domein werd verder verfijnd door gerichte 3D-verfijning met behulp van een zacht masker, dat de ongeordende TOPRIM invoeging uitsluit, wat een 4,0 Å kaart van hoge kwaliteit oplevert (Supplementary Fig. 3).
Alle gerapporteerde resoluties zijn gebaseerd op de gouden standaard FSC-0.143 criterium57 en FSC-curven werden gecorrigeerd voor de convolutie effecten van een zachte masker met behulp van hoge-resolutie ruis-substitutie58 in RELION2 evenals in cryoSPARC (Supplementary Fig. 4a). Alle reconstructies werden verscherpt door toepassing van een negatieve B-factor die werd geschat met behulp van geautomatiseerde procedures59. Lokale resolutie van de kaarten werd berekend met behulp van Blocres60 (Supplementary Fig. 4c). De cryo-EM kaarten van het totale complex, ATPase-kern, CTD-kern en het DNA-bindende/cleavage domein in gesloten (met en zonder TOPRIM insertie) en in pre-opening toestand zijn gedeponeerd in de EM Data Bank onder toetredingsnummers EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, respectievelijk.
Modelbouw en verfijning
De EM-reconstructie van het DNA-bindende/afbrekende domein zonder de TOPRIM-insertie, opgelost op 4,0 Å, was van de beste kwaliteit. Bijna alle zijketens konden worden gezien en de dichtheid van Gepotidacin was duidelijk zichtbaar. Deze kaart werd gebruikt om een kristalstructuur te verfijnen van het DNA-bindende/cleavage domein van het E. coli DNA gyrase17. Een dimeer atomair model van het DNA-bindende/cleavage domein werd gegenereerd met behulp van PDB 3NUH in PyMol (Schrodinger L.L.C.). Het daaropvolgende atoommodel werd ontdaan van aminozuren die behoren tot de TOPRIM insertie, alle ionen en watermoleculen, waarbij alle bezettingsgraden op 1 werden gezet en de B-factoren op 50. Eerst werd het atoommodel rigid-body gemonteerd in de gefilterde en verscherpte kaart met Chimera 61. Een eerste ronde van real-ruimte verfijning in PHENIX62 werd uitgevoerd met behulp van lokale real-ruimte aanpassing en globale gradiënt-gestuurde minimalisatie verfijning. Vervolgens werden 20 nucleïnezuren uit de structuur van S. aureus DNA gyrase41 (PDB 5IWM) gekopieerd en ingepast in ons atomaire model. De DNA-sequentie werd aangepast aan het DNA dat in onze structuur werd gebruikt. Ontbrekende eiwitresiduen en nucleïnezuren werden handmatig opgebouwd in COOT63. Atomisch model en constraint dictionary van gepotidacin (GSK-2140944) werden gegenereerd met de Grade server (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacin werd vervolgens handmatig ingepast in de lege elektronendichtheid in COOT en vervolgens gedupliceerd. Beide duplicaten werden ingesteld op 0,5 bezetting. Verschillende rondes van real-space verfijning in PHENIX met gebruikmaking van restricties voor secundaire structuur, rotamers, Ramachandran, en niet-kristallografische symmetrie werden uitgevoerd, steeds gevolgd door handmatige inspectie in COOT, totdat een convergerend model was verkregen. Tenslotte werden de B-factoren verfijnd door een laatste ronde van real-space verfijning in PHENIX met dezelfde instellingen als voorheen. Nadat de verfijning was geconvergeerd, werden de atoomcoördinaten van de TOPRIM-insertie aan het atoommodel toegevoegd. Het werd verder verfijnd in de EM-reconstructies met de insertiedichtheid in gesloten en pre-open toestand volgens dezelfde procedure. Een halve-map kruisvalidatie werd uitgevoerd om 1.5 te definiëren als het beste verfijningsgewicht in PHENIX om atoom botsingen te verminderen en overfitting van het model te voorkomen (supplementaire Fig. 4e). Alle verfijningsstappen werden uitgevoerd met de resolutielimiet van de reconstructies volgens het gouden standaard FSC-0.143 criterium57. Verfijningsparameters, modelstatistieken en validatiescores zijn samengevat in supplementaire tabel 2. De atoommodellen van het E. coli DNA-bindende/cleavage domein in gesloten (met en zonder insertie) en pre-opening conformatie zijn gedeponeerd in de Protein Data Bank onder toetredingsnummers 6RKU, 6RKS, 6RKV, respectievelijk.
Voor het totale complex hebben we een combinatie van verschillende EM-reconstructies gebruikt om het DNA gyrase totale complex atoommodel te bouwen. De ATPase-kernstructuur, opgelost op 5.9 Å, werd gebruikt om de ATPase-domein kristalstructuur in complex met ADPNP32 (PDB 1EI1) en het DNA-bindende/cleavage domein, verfijnd in gesloten conformatie, in Chimera rigid-body te passen. De kwaliteit van de elektronendichtheid maakte het mogelijk om in COOT de ontbrekende residuen van de link tussen het ATPase domein en het DNA-bindende/cleavage domein op te bouwen. De CTD-Core structuur, opgelost op 6.3 Å, werd gebruikt om de β-pinwheel kristalstructuur10 in Chimera nauwkeurig te passen. De 10 ontbrekende aminozuren (564-574) na de GyrA-box werden toegevoegd met behulp van de modelleerserver Phyre264. De kwaliteit van de elektronische dichtheid maakte het mogelijk om in COOT de ontbrekende nucleïnezuren rond het β-pinwiel te bouwen, evenals de 10 aminozuren die de laatste GyrA residuen verbinden met het β-pinwiel. Op basis van een secundaire structuurvoorspelling werd een deel van de linker als een alfa-helix opgebouwd (Fig. 3). Het daaropvolgende atomaire model dat het ATPase domein, het DNA-bindende/cleavage domein en één β-pinwheel bevatte, werd met behulp van Chimera op 6.6 Å rigid-body ingepast in de algemene structuur van het complex. Vervolgens werd een kopie van het eerste β-pinwheel ingepast in de dichtheid van het tweede β-pinwheel in COOT. De ontbrekende nucleïnezuren rond het tweede β-pinwheel en de ontbrekende 10 residuen van de linker werden handmatig in COOT opgebouwd. Het resulterende atoommodel werd ontdaan van alle ionen en watermoleculen, waarbij alle bezettingsgraden op 1 werden gezet en de B-factoren op 50. Tenslotte werd het atoommodel in PHENIX verfijnd met behulp van rigid-body en globale gradiënt-gestuurde minimalisatie-verfijning. De resolutiegrens voor verfijning werd ingesteld volgens het gouden standaard FSC-0.143 criterium57. Half-map kruisvalidaties werden ook uitgevoerd (Supplementary Fig. 4e). Verfijning parameters, model statistieken en validatie scores zijn samengevat in aanvullende tabel 2. Het atomaire model van de totale structuur is gedeponeerd in de Protein Data Bank onder toetredingsnummers 6RKW. Alle figuren zijn gemaakt met Chimera61, ChimeraX65 en PyMol (Schrodinger L.L.C.).
E. coli GyrB R286K, R286Q, en E264A zuivering
De gemodificeerde pET28b gebruikt voor wild-type E. coli GyrB overexpressie werd gemuteerd door site-directed mutagenese met behulp van de QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) om drie plasmiden harboring R286K, R286Q, of E264A mutaties (Supplementary Tabel 4) te genereren. Overexpressie en zuivering procedures voor de drie mutanten zijn identiek aan de wild-type GyrB hierboven beschreven in de Methods section.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q zuivering
De gewijzigde pET28b gebruikt voor wild-type T. thermophilus GyrB overexpressie 12 werd gemuteerd door site-directed mutagenese met behulp van de QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) om twee plasmiden harboring K284R of K284Q mutaties (Supplementary Tabel 4) te genereren. Overexpressie en zuivering procedures voor de twee mutanten zijn identiek aan de E. coli wild-type GyrB hierboven beschreven in de sectie Methoden.
DNA supercoiling assay
Een toenemende concentratie van DNA gyrase (GyrA2B2) werd geïncubeerd bij 37 ° C met 6 nM van ontspannen pUC19 plasmide in een reactiemengsel met 20 mM Tris-acetaat pH 7,9, 100 mM kaliumacetaat, 10 mM magnesiumacetaat, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Na 30 minuten werden de reacties gestopt door toevoeging van SDS 1%. Agarosegel-elektroforese werd gebruikt om de omzetting van ontspannen pUC19 in de supercoiled vorm te controleren. De monsters werden uitgevoerd op een 0,8% agarose, 1X Tris Borate EDTA buffer (TBE) gel, bij 6 V/cm gedurende 180 min bij kamertemperatuur. Agarosegels werden gekleurd met 0,5 mg/ml ethidiumbromide in 1X TBE gedurende 15 min, gevolgd door 5 min ontkleuren in water. DNA topoisomeren werden onthuld met een Typhoon (GE Healthcare).
ATPase activiteit assay
ATP hydrolyse wordt gemeten door het volgen van de oxidatie van NADH gemedieerd door pyruvaat kinase (PK) en lactaat dehydrogenase (LDH). De absorptie werd gevolgd bij 340 nm gedurende 600 s bij 37 °C met een Shimadzu 1700 spectrofotometer. De reacties werden opgenomen in drievoud met 50-100 nM GyrA2B2 en 16 nM lineair DNA (pCR-blunt) in 500 µl van een buffer die 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM kaliumacetaat, 8 mM magnesiumacetaat, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U van PK/LDH-mengsel, 2 mM PEP, en 0.2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sequences from 30 species (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis; GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) werden uitgelijnd met behulp van de Clustal Omega server (EMBL-EBI). De daaropvolgende uitlijning werd gebruikt om de evolutionaire conservatie van aminozuren te plotten op de ATPase/transducer structuur (PDB ID 1EI1) met behulp van de ConSurf server (http://consurf.tau.ac.il). De fylogenetische boom werd gegenereerd door de neighbor-joining methode met behulp van de meervoudige uitlijning in Clustal Omega.
Rapportage samenvatting
Meer informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.